內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子在2型糖尿病小鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)常見的并發(fā)癥，80％的DM患者死于動(dòng)脈粥樣硬化，DM患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的幾率是非DM患者的2-4倍，而2型糖尿病(type2 diabetes，T2DM)約占整個(gè)DM病例的90％。長期以來，研究人員針對(duì)DM促發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制做了大量研究。目前，DM致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理主要包括:高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AG

2、Es)的形成、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活以及氧化應(yīng)激水平增高。近年來的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在DM動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。但是ERS作為DM動(dòng)脈粥樣硬化致病機(jī)理的研究才剛剛開始，許多問題尚未明確，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子機(jī)制還有待更深入的研究。
　　因此，為了探討ERS在T2DM動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)

3、通過高脂高糖飲食喂養(yǎng)聯(lián)合6周齡時(shí)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)，在apoE-/-/LDLR-/-(AL)小鼠的基礎(chǔ)上建立了T2DM動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，ND組注射檸檬酸緩沖液作對(duì)照。小鼠10周齡時(shí)，檢測體重、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-insulin resistant，HOMA-IR)以及糖耐量實(shí)驗(yàn)(Glucose tolerance t

4、est，GTT)確定T2DM建模成功。T2DM和ND組小鼠分別于10周齡、18周齡解剖、取材檢測(n≥10)，我們綜合分析了T2DM組小鼠主動(dòng)脈弓部，根部以及主動(dòng)脈大體的動(dòng)脈粥樣硬化病變，檢測了ERS相關(guān)因子在主動(dòng)脈根部的表達(dá)，探討了T2DM在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制，為T2DM動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療，提供有價(jià)值的參考依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，1:與 ND組小鼠相比，T2DM組小鼠8周齡時(shí)體重低(P＜0.05)，并

5、一直持續(xù)到18周齡。T2DM組小鼠在STZ注射4周即10周齡時(shí)表現(xiàn)為高血糖，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P＜0.01)。另外，T2DM組小鼠表現(xiàn)為胰島素水平升高(P＜0.05)，胰島素抵抗(P＜0.01)。GTT結(jié)果顯示，T2DM組小鼠在10周齡和18周齡時(shí)與 ND組小鼠相比表現(xiàn)出葡萄糖耐量異常。T2DM組小鼠血清 TC、TG水平較 ND組明顯升高(P＜0.01)，并持續(xù)至18周齡。實(shí)驗(yàn)過程中，T2DM組小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇(low den

6、sity lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平一直高于NG組小鼠(P＜0.01)。T2DM組小鼠表現(xiàn)為高血糖、高血脂、IR以及糖耐量異常，以上數(shù)據(jù)表明，我們已在AL小鼠的基礎(chǔ)上成功建立了T2DM動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。
　　2:為了研究T2DM在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生中的作用，我們

7、對(duì)兩組小鼠主動(dòng)脈根部和全長主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩組小鼠10周齡、18周齡主動(dòng)脈根部瓣膜處均有不同程度的蘇丹Ⅳ陽性染色區(qū)，表明主動(dòng)脈瓣膜處動(dòng)脈壁發(fā)生脂質(zhì)沉積，伴有泡沫細(xì)胞聚集。T2DM組小鼠18周齡時(shí)，主動(dòng)脈根部斑塊分布區(qū)域增多，斑塊面積進(jìn)一步增大，吞噬脂質(zhì)程度進(jìn)一步加重，蘇丹Ⅳ染色著色弱，血管壁變薄，在病變嚴(yán)重的區(qū)域，斑塊內(nèi)部出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶和壞死核心。隨著年齡的增長，兩組小鼠主動(dòng)脈根部平均病變面積逐漸增大。T2DM組

8、小鼠主動(dòng)脈根部平均病變面積較 ND組在10周齡有顯著性差異(P＜0.05)，18周齡有極顯著性差異(P＜0.01)。全長主動(dòng)脈油紅 O染色顯示內(nèi)表面病變，T2DM小鼠10周齡、18周齡全長主動(dòng)脈油紅 O陽性染色區(qū)域明顯高于同年齡段 ND組小鼠。
　　3:實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示，與 ND小鼠相比，T2DM組小鼠10周齡時(shí) ERS標(biāo)志因子(glucose-regulated protein78，GRP78)、(C/EBP homol

9、ogous protein，CHOP)表達(dá)水平明顯升高，并持續(xù)至18周齡。T2DM組小鼠細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)因子 Caspase12、JNK2表達(dá)水平在18周齡時(shí)顯著升高，并與 ND組有顯著性差異(P＜0.01)。
　　GRP78免疫組化結(jié)果顯示，在動(dòng)脈粥樣硬化初期，ND組小鼠10周齡時(shí)ERS標(biāo)志性因子GRP78在斑塊內(nèi)已有較高的表達(dá)，其中T2DM組較ND小鼠斑塊內(nèi)GRP78表達(dá)增加。在動(dòng)脈粥樣硬化晚期，T2DM組小鼠18周齡時(shí)主動(dòng)脈

10、粥樣硬化斑塊中膜平滑肌處GRP78有較高表達(dá)，ND組則無明顯表達(dá)。ERS標(biāo)志因子CHOP是ERS促凋亡途徑的特有產(chǎn)物，其編碼的蛋白質(zhì)屬于CCAA/增強(qiáng)子相連蛋白的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族，與各種細(xì)胞活動(dòng)如能量代謝、增殖、分化及凋亡相關(guān)。CHOP阻滯細(xì)胞分裂周期可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CHOP免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在ND組小鼠10周齡和18周齡時(shí)，主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CHOP表達(dá)非常低。T2DM組小鼠10周齡時(shí)，CHOP在主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)已有表

11、達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化晚期，T2DM組小鼠18周齡時(shí)CHOP表達(dá)增加。Actived-Caspase3免疫組化結(jié)果顯示，T2DM組小鼠在10周齡時(shí)斑塊內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，18周齡時(shí)凋亡增加，ND組則未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡會(huì)直接造成壞死核心的形成以及斑塊不穩(wěn)定，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)壞死核心面積分析結(jié)果顯示，T2DM組小鼠18周齡時(shí)主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊壞死核心面積較ND組小鼠顯著升高(P＜0.01)。
　　以上結(jié)果表明，