超聲微泡載EGFP質粒DNA轉染新生血管性角膜組織的實驗研究.pdf

1、角膜是眼球重要的屈光介質之一，無血管組織是其主要特點，在各種病理條件下新生血管長入透明角膜中，導致角膜新生血管（Corneal neovascular，CNV）生成。其所致的角膜新生血管性疾病是目前致盲的主要原因之一，因此抑制角膜新生血管形成是挽救角膜盲患者視力，提高患者生活質量的重要途徑之一。近年來，抑制角膜新生血管的研究熱點是基因治療，但現(xiàn)有基因轉染方法及基因載體不能令人滿意。因此，尋找安全、高效、可控和簡便實用的基因載體及基因轉染

2、方法已成為基因治療研究的重點。研究發(fā)現(xiàn)，超聲醫(yī)學在長期發(fā)展中，從診斷超聲、治療超聲走向兩個新的應用領域：藥物輸送和基因治療。超聲靶向破壞微泡（Ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）所產生的機械效應和空化效應能夠增加細胞膜的通透性，促進外源物質進入靶細胞。本課題第一部分探索性的利用超聲聯(lián)合微泡作用于活體正常角膜組織，研究其對正常角膜組織的生物學效應；第二部分在成功制備兔角膜新生血

3、管模型的基礎上，采用超聲微泡作為載體，運載基因至活體角膜組織，檢測基因轉染效率，探討了超聲微泡作為靶向載體轉染外源基因的可行性和效率，為新生血管性角膜疾病的治療提供了一種新思路和新手段。 第一部分超聲微泡對正常角膜組織的生物效應 目的:觀察不同聲強和輻照時間的超聲破壞微泡對兔正常角膜組織的生物學效應。 方法:采用不同聲強（0.5 W/c㎡，1.0 W/c㎡，2.0W/c㎡）和輻照時間（30 s，60 s，120

4、s）的超聲作用于微泡干預的兔眼角膜，并對角膜進行定量分析和組織學觀察。 結果:超聲聲強1.0、2.0W/c㎡與0.5 W/c㎡組比較，角膜組織損害嚴重，內皮細胞密度（endothelial cell density，ECD），六角形細胞比例（percentage of hexagonal，6A）差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；超聲輻照時間120 s與30 s、60 s比較，內皮細胞密度（ECD），六角形細胞比例（6A）差異有統(tǒng)

5、計學意義（p<0.05）。 結論:超聲聯(lián)合微泡能明顯增強角膜組織的空化效應，且超聲能量越大，角膜組織損害越嚴重。 第二部分載EGFP質粒DNA超聲微泡轉染新生血管性角膜組織的研究 目的:探討超聲微泡載EGFP質粒DNA轉染新生血管性角膜組織的可行性及效率。 方法:采用縫線法誘導角膜新生血管模型成功后，利用隨機分組法將其分為四組：A組裸質粒組；B組質粒加超聲輻照組；C組質粒-微泡復合物組；D組質粒-微泡復合

6、物加超聲輻照組。質粒轉染后HE染色觀察角膜組織病理變化，并采用激光共聚焦顯微鏡觀察質粒DNA熒光蛋白表達強度。 結果:D組（133.03±21.99）熒光蛋白表達強度明顯高于A組、B組和C組（A組：75.17±7.08；B組：97.02±8.31；C組：81.83±9.44），差異有統(tǒng)計學意義（F=23.56，P<0.05）。 結論:在一定聲強和輻照時間的超聲作用下，超聲微泡能有效提高質粒DNA在新生血管性角膜組織的基因