超聲輻照SonoVue介導pEGFP-N1轉(zhuǎn)染眼組織細胞的實驗研究.pdf

1、多種難治性眼科疾病，在臨床上沒有非常有效的治療手段，采用基因治療技術(shù)成為攻克該類疾病的研究方向。目前在眼基因治療中使用的基因?qū)胂到y(tǒng)，分為病毒載體和非病毒載體系統(tǒng)兩大類，分別具有不同的缺陷，限制了臨床應用。超聲輻照微泡造影劑介導基因轉(zhuǎn)染是具有廣闊發(fā)展前景的新的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，且在眼科方面缺乏系統(tǒng)的研究。本研究擬用國內(nèi)首先用于臨床的超聲微泡造影劑聲諾維(SonoVue)聯(lián)合超聲輻照介導增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-N1)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的眼基

2、因治療的靶細胞，探討達到較佳轉(zhuǎn)染效率和較小細胞損傷的最優(yōu)超聲輻照條件，然后參照體外實驗結(jié)果，探索體內(nèi)轉(zhuǎn)染眼角膜組織的可行性、轉(zhuǎn)染效率和安全性，構(gòu)建超聲輻照微泡造影劑介導眼基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)平臺，為眼科疾病的基因治療開辟一個新的途徑。 第Ⅰ部分體外實驗：超聲輻照微泡造影劑Sonovue介導pEGFP-N1轉(zhuǎn)染RPE細胞的實驗研究 第一章：聲諾維聯(lián)合超聲輻照對RPE細胞增殖和細胞活性的影響 目的：探討微泡造影劑聲諾維(S

3、onoVue)聯(lián)合超聲輻照對RPE細胞增殖和細胞活性的影響。 方法：hRPE細胞復蘇后以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。對照組不處理，實驗組分為超聲聲強、輻照時間、造影劑濃度、超聲形式組，均以不同劑量的超聲輻照。各組細胞超聲輻照后培養(yǎng)24h，每孔加入MTT和DMSO后，在酶標儀上測吸光度值，計算細胞存活率，比較各組吸光度值與細胞存活率的差異。 結(jié)果：實驗組的吸光度值較對照組有不同程度的降低，各組間差異有顯

4、著性意義(P=0.0001)。超聲輻照微泡造影劑對細胞增殖和細胞活性有抑制作用，隨著聲強增加，輻照時間延長，造影劑濃度的增加，細胞的吸光度值和細胞活性逐漸降低。造影劑濃度為20％，脈沖重復頻率50Hz，3W/cm2脈沖波輻照1min；造影劑濃度為20％，50Hz，2W/cm2脈沖波輻照4min；造影劑濃度為20％，1W/cm2連續(xù)波輻照1min；造影劑濃度為50％或造影劑濃度為100％，50Hz，2W/cm2脈沖波輻照1min組與對照組

5、比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。其余各組與對照組比差異無顯著性意義(P＞0.05)。 結(jié)論：超聲輻照聲諾維對RPE細胞的增殖和細胞活性有抑制作用，隨著聲強增加，輻照時間延長，脈沖波變?yōu)檫B續(xù)波及造影劑濃度的增加，細胞生存率逐漸下降。造影劑濃度均為20％時，脈沖重復頻率50Hz，1W/cm2脈沖波輻照1min；脈沖重復頻率50Hz，2W/cm2脈沖波輻照1min或2min；脈沖重復頻率100Hz，1W/cm2脈沖波輻照1min

6、對RPE細胞無明顯損傷。 第二章：聲諾維聯(lián)合超聲輻照介導pEGFP-N1轉(zhuǎn)染RPE細胞的輻照條件優(yōu)化研究 目的：探討微泡造影劑聲諾維聯(lián)合超聲輻照介導綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-N1)轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮(hRPE)細胞的最佳輻照條件。 方法：hRPE細胞復蘇后以2×105/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。質(zhì)粒用量2μg孔，分為對照組、單純超聲輻照組、造影劑濃度組、超聲聲強組、輻照時間組、聲波形式組6組，每組

7、10個細胞孔數(shù)。超聲探頭緊貼培養(yǎng)板底部以不同劑量輻照，倒置熒光顯微鏡觀察各組基因轉(zhuǎn)染情況，72h后收集細胞流式細胞儀測基因轉(zhuǎn)染率。四甲基偶氮唑藍法(MTT)測細胞活性。比較各組基因轉(zhuǎn)染率和細胞生存率得出最佳輻照條件。 結(jié)果：實驗組基因轉(zhuǎn)染率均大于對照組。微泡造影劑聲諾維能明顯增加超聲輻照介導基因轉(zhuǎn)染RPE細胞的效率。20％的造影劑，50Hz的脈沖波，聲強為3W/cm2，輻照1min組轉(zhuǎn)染率最高(20.86±2.63)％，而細胞生

8、存率為(82.58±10.46)％。20％的造影劑，50Hz的脈沖波，聲強為2W/cm2，輻照1min組轉(zhuǎn)染率為(15.81±1.70)％，細胞生存率為(91.29±2.62)％。上述兩組的基因轉(zhuǎn)染率與其他各組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)，兩組之間比較，前者的細胞生存率更低，且差異有顯著性意義(P＜0.05)。 結(jié)論：微泡造影劑聲諾維能明顯增加超聲輻照介導基因轉(zhuǎn)染RPE細胞的效率。20％的造影劑，2W/cm2，50Hz脈

9、沖波輻照1min是最佳輻照條件。 第三章：聲諾維聯(lián)合超聲輻照增強脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染RPE細胞的實驗研究 目的：比較聲諾維聯(lián)合超聲輻照法與脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染RPE細胞的轉(zhuǎn)染效率和安全性，探討超聲聯(lián)合微泡法增強脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率的可行性。 方法：hRPE培養(yǎng)在24孔板，質(zhì)粒用量2μg孔，分為對照組、超聲輻照組(50Hz的脈沖波，2W/cm2，輻照1min)、造影劑+超聲輻照組(20％的造影劑濃度，50Hz的脈沖波，2W

10、/cm2或3W/cm2，輻照1min)、脂質(zhì)體組、脂質(zhì)體+造影劑+超聲輻照組5組，每組10個細胞孔數(shù)，超聲探頭緊貼培養(yǎng)板底部輻照，倒置熒光顯微鏡觀察各組基因轉(zhuǎn)染情況，72h后流式細胞儀測基因轉(zhuǎn)染率，AnnexinV-FITC和PI雙染流式細胞儀法檢測細胞凋亡率。比較各組基因轉(zhuǎn)染率和細胞凋亡率。 結(jié)果：單純超聲輻照組基因轉(zhuǎn)染率為(1.06±0.13)％，超聲聯(lián)合微泡造影劑組為(15.81±1.70)％和(20.86±2.63)％。

11、脂質(zhì)體組的基因轉(zhuǎn)染率為(30.06±3.49)％，高于超聲聯(lián)合微泡組，兩組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。脂質(zhì)體+超聲+微泡組的基因轉(zhuǎn)染率為(44.51±1.28)％，高于脂質(zhì)體組，兩組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。 結(jié)論：脂質(zhì)體介導EGFP轉(zhuǎn)染RPE細胞的效率高于聲諾維聯(lián)合超聲輻照介導的轉(zhuǎn)染效率。聲諾維聯(lián)合超聲輻照能明顯提高脂質(zhì)體介導EGFP轉(zhuǎn)染RPE細胞的轉(zhuǎn)染效率。 第Ⅱ部分體內(nèi)實驗：超聲輻照微泡造影劑

12、介導pEGFP-N1在體轉(zhuǎn)染小鼠角膜的實驗研究 目的：探討微泡造影劑聲諾維聯(lián)合超聲介導綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠角膜的效率和安全性。 方法：40只昆明小鼠隨機分為4組。小鼠前房分別注射生理鹽水、質(zhì)粒+生理鹽水、質(zhì)粒+造影劑、脂質(zhì)體+質(zhì)粒等，以50Hz，2W/cm2的脈沖波超聲輻照質(zhì)粒+生理鹽水和質(zhì)粒+造影劑眼10min。術(shù)后第1d、3d、7d、14d、21d熒光體視鏡觀察眼表EGFP表達出現(xiàn)情況，術(shù)后第3d各組隨機選取2只

13、小鼠摘取眼球，冰凍切片熒光顯微鏡觀察陽性細胞的分布，病理切片觀察角膜組織有無損傷。 結(jié)果：術(shù)后1d造影劑聯(lián)合超聲輻照組小鼠眼表出現(xiàn)綠色熒光蛋白的彌漫性表達(呈強陽性(++))，明顯高于單純超聲輻照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(呈弱陽性(+))，其余對照各組眼表均未見綠色熒光(呈陰性(-))。造影劑聯(lián)合超聲組眼表EGFP熒光亮度、范圍術(shù)后3d時與1d相比有增加，主要出現(xiàn)在角膜，7d時，熒光開始下降；21d時基本消失。單純超聲輻照組眼表EGFP