超聲輻照SonoVue介導(dǎo)CD-TK基因靶向治療乳腺癌的體外實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌是威脅女性健康的主要疾病之一,發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。由于傳統(tǒng)的治療方法有其自身的局限性,尋找新的療法迫在眉睫。隨著分子生物學(xué)及基因工程的迅速發(fā)展,基因治療已成為惡性腫瘤治療的有效手段之一。自殺基因療法以其獨特的作用機制在乳腺癌治療中備受關(guān)注。聯(lián)合應(yīng)用胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)、單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋(HSV-TK/GCV)兩大自殺基因系統(tǒng)可以利用兩系統(tǒng)的互補作用,提高腫瘤

2、殺傷作用,改善治療效果,而且可以擴大腫瘤治療譜,減少耐藥現(xiàn)象發(fā)生。
　　 靶向和高效是基因治療的關(guān)鍵和瓶頸問題,也是基因治療能否在臨床上得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。癌組織特異性啟動子介導(dǎo)的靶向治療策略的應(yīng)用以及超聲微泡載體的出現(xiàn)為基因治療乳腺癌展現(xiàn)出了一個全新的應(yīng)用前景。
　　 KDR啟動子在增生活躍的腫瘤血管內(nèi)皮細胞及多數(shù)腫瘤細胞高表達而在正常組織不表達或表達甚微。研究表明,其驅(qū)動外源性自殺基因,可使自殺基因在腫瘤血管內(nèi)皮

3、細胞及腫瘤細胞特異性表達,達到雙重靶向治療的作用,同時減少對正常組織的毒副作用。
　　 病毒載體和常用的非病毒載體脂質(zhì)體分別存在高免疫原性及具有毒性、體內(nèi)轉(zhuǎn)染率低的不足,而且缺乏靶向性。目前,超聲在基因和藥物靶向傳輸中的應(yīng)用是正在興起的研究熱點。其核心是應(yīng)用超聲波及聲學(xué)造影劑微氣泡發(fā)展基因和藥物定向傳輸及釋放技術(shù),即超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是將聲學(xué)造影劑微氣泡耦連或包載靶向基因或藥物,使載基因或藥物微泡在顯影組

4、織的同時,利用聲學(xué)造影劑微氣泡在超聲場內(nèi)發(fā)生的空化效應(yīng),將基因和藥物運載和釋放到特定的組織和器官,使局部組織達到有效的治療濃度。已有充分研究證實該系統(tǒng)的可行性和應(yīng)用前景,其具有全身給藥少、局部濃度高、無創(chuàng)、簡便、并可在床邊進行等優(yōu)點,給予當前靶向性差、正處于低迷狀態(tài)的基因療法以新的希望。
　　 目的：
　　 1.篩選超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細胞的最適參數(shù)條件,并檢測它作為基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在MCF-7細胞中的轉(zhuǎn)染

5、效率,探討該技術(shù)用于MCF-7細胞基因轉(zhuǎn)移的可行性。
　　 2.采用篩選出的最適超聲輻照微泡參數(shù)轉(zhuǎn)染含有KDR啟動子及CD/TK基因的重組質(zhì)粒pEGFP-KDRP-CD/TK于高表達KDR的人乳腺癌MCF-7細胞及不表達KDR的人結(jié)腸癌LS174T細胞,探討KDR啟動子驅(qū)動雙自殺基因CD/TK對MCF-7細胞的體外靶向殺傷作用。
　　 方法
　　 1.以不同超聲強度(0.5W/cm2、0.75W/cm2、1W/c

6、m2、1.25W/cm2)及不同超聲輻照時間(10s、30s、45s、60s)的超聲參數(shù)聯(lián)合一定濃度微泡作用于對數(shù)生長期的MCF-7細胞,通過MTT染色,篩選出對細胞活性無明顯抑制的超聲參數(shù)。
　　 2.將MCF-7細胞分成5組:①裸質(zhì)粒組(NP),②聲諾維微泡組(MV),③超聲組(US),④超聲+聲諾維微泡組(US&MV),⑤脂質(zhì)體組(LP)。用上述不同基因轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染pEGFP-C2質(zhì)粒,通過觀察、計數(shù)表達綠色熒光蛋白細胞,

7、比較各組轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.用篩選出的最適超聲微泡參數(shù)轉(zhuǎn)染含有KDR啟動子及CD/TK基因的重組質(zhì)粒pEGFP-KDRP-CD/TK于表達KDR的MCF-7細胞及不表達KDR.的LS174T細胞,通過綠色熒光蛋白表達比較基因轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR檢測目的基因CD/TK的表達。在前藥5-FC和/或GCV作用下,MTT測定腫瘤細胞的生長抑制率,觀察自殺基因的協(xié)同效應(yīng)及旁觀者效應(yīng)。
　　 結(jié)果：
　　 1.細胞存活率

8、隨著超聲強度的增強及輻照時間的延長而降低,當超聲強度為0.75W/cm2、輻照45s和超聲強度1W/cm2、輻照30s時,MCF-7細胞存活率仍>90％,對細胞損傷小,是用于MCF-7細胞基因轉(zhuǎn)染的最適參數(shù)。
　　 2.五組細胞轉(zhuǎn)染后,超聲組和微泡組僅見很少的綠色熒光細胞；而超聲微泡組與脂質(zhì)體組均見大量的綠色熒光細胞,轉(zhuǎn)染率分別為(23.87±2.74)％和(22.03±2.29)％,兩者比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；超聲

9、微泡組的轉(zhuǎn)染率明顯高于單純超聲組或單純微泡組(P<0.001)。
　　 3.超聲輻照聲諾維微泡介導(dǎo)DEGFP-KDRP-CD/TK基因轉(zhuǎn)染MCF-7細胞及LS174T細胞后,通過熒光顯微鏡觀察兩種細胞均被轉(zhuǎn)染,且轉(zhuǎn)染效率相似,分別為(21.92±3.64)％、(20.97±2.74)％,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染pEGFP-KDRP-CD/TK的MCF-7細胞內(nèi)有CD/TK目

10、的基因的表達,而LS174T細胞未檢測到目的基因的表達。
　　 5.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的MCF-7細胞對前藥具有較高的敏感性,單獨用前藥5-FC、GCV與聯(lián)合用藥細胞抑制率分別為(38.16±1.56)％、(37.29±1.95)％及(61.22±0.70)％,聯(lián)合用藥較單獨用藥差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),且各組細胞抑制率均顯著高于基因轉(zhuǎn)染率(21.92±3.64)％(P<0.001)；而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的LS174T細胞對前藥

11、不敏感,聯(lián)合用藥較單獨用藥,細胞抑制率無顯著差別(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.超聲輻照聲諾維微泡介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染MCF-7細胞的最適超聲參數(shù)為聲強0.75 W/cm2,輻照45s或聲強1 W/cm2,輻照30s。
　　 2.超聲微泡是一種安全、高效、靶向的基因傳遞系統(tǒng)。
　　 3.超聲輻照聲諾維轉(zhuǎn)染pEGFP-KDRP-CD/TK重組質(zhì)粒于MCF-7細胞和LS174T細胞,二者均具有較高的轉(zhuǎn)