腺病毒介導(dǎo)的VEGF啟動子-CD-TK融合基因系統(tǒng)的構(gòu)建與體外抑瘤研究.pdf

1、目的:一、應(yīng)用AdEasier-1系統(tǒng)制備含VEGF啟動子驅(qū)動的CD/TK融合基因的重組腺病毒質(zhì)粒,經(jīng)293細(xì)胞包裝、擴(kuò)增獲取重組腺病毒.行氯化銫密度梯度離心純化,并行PCR鑒定.二、應(yīng)用含VEGF啟動子驅(qū)動的CD/TK融合基因的重組腺病毒感染LOVO細(xì)胞,在前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韋(GCV)作用下,測定腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞存活率以觀察腺病毒介導(dǎo)的CD/5-FC和HSV-TK/GCV系統(tǒng)對大腸癌細(xì)胞的體外殺傷

2、效應(yīng).方法:一、構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK 首先,用Not Ⅰ和Xho Ⅰ切下pEGFP-1-SV-VEGFP上的VEGFP,亞克隆至pAdtrack構(gòu)建pAdtrack-VEGFP.再分別以JM109細(xì)菌和pREP8-TK為模板,PCR擴(kuò)增出CD和TK基因片段,亞克隆到中間載體pcDNA3構(gòu)建含CDglyTK融合基因的pcDNA3-CDglyTK.用HindⅢ和Pvu Ⅱ酶切,回收純化一大小約2.6kb、

3、含polyA尾的片段CDglyTK-pA,插入到穿梭質(zhì)粒pAdtrack-VEGFP上構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK,行酶切鑒定.二、構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK 用PmeⅠ酶切線性化pAdtrack-VEGFP-CDglyTK,轉(zhuǎn)化用氯化鈣法制備的AdEasier-1感受態(tài)細(xì)菌,使pAdtrack-VEGFP-CDglyTK和腺病毒基因組pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)

4、行同源重組.抽提質(zhì)粒,行電泳和Pac Ⅰ酶切鑒定獲取正確的重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK.三、293細(xì)胞包裝、擴(kuò)增重組腺病毒 用經(jīng)Pac Ⅰ酶切線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK,按LipofectAMINE2000產(chǎn)品說明書轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況.轉(zhuǎn)染后第14d收集細(xì)胞,反復(fù)凍融(-70℃,1h/37℃,3min/振蕩,lmin)4次收集病毒上清.取1

5、/2病毒上清感染293細(xì)胞,5d后收集細(xì)胞,以相同的凍融法收集病毒上清.如此反復(fù)取病毒上清感染293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增(共4次),收集病毒上清.行氯化銫密度梯度離心法純化并用紫外分光光度計測定重組腺病毒滴度.四、腺病毒介導(dǎo)的VEGF啟動子-CDglyTK融合基因系統(tǒng)對LOVO細(xì)胞的體外殺傷作用 應(yīng)用含VEGF啟動子驅(qū)動的CDglyTK融合基因的重組腺病毒感染LOVO細(xì)胞,在前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韋(GCV)作用下,測定腫

6、瘤細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞存活率.結(jié)論:該研究應(yīng)用AdFasier-1系統(tǒng)制備了含VEGFP驅(qū)動CD/TK自殺基因系統(tǒng)的重組腺病毒,并用獲得的重組腺病毒感染LOVO細(xì)胞,在前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韋(GCV)作用下,測定腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞存活率,初步觀察腺病毒介導(dǎo)的CD/5-FC和HSV-TK/GCV系統(tǒng)對大腸癌細(xì)胞的殺傷作用,得出如下結(jié)論:1、該實(shí)驗(yàn)于國內(nèi)首先應(yīng)用AdEasier-1系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒.2

7、、利用AdEasier-1系統(tǒng)可以成功構(gòu)建含VEGFP驅(qū)動CD/TK自殺基因系統(tǒng)的重組腺病毒,成功率為70％,重組腺病毒的滴度達(dá)3.2×10<'11>病毒顆粒/m1.3、重組腺病毒能將VEGFP驅(qū)動的CD/TK融合基因?qū)隠OVO細(xì)胞中并進(jìn)行有效表達(dá),產(chǎn)生具有生物活性的前藥轉(zhuǎn)換酶大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶和單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶.4、聯(lián)合應(yīng)用CD/5-FC和HSV-TK/GCV系統(tǒng)的腫瘤殺傷效應(yīng)比單獨(dú)應(yīng)用CD/5-FC或HSV-TK/G