超聲輻照微泡介導(dǎo)雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)裸鼠乳腺癌體內(nèi)抑瘤作用的研究.pdf

1、研究背景
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,已嚴(yán)重威脅女性健康。隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入,以及分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展,基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式,其中自殺基因治療作為一種頗具臨床應(yīng)用潛力的治療策略,是近年來(lái)腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。
　　 自殺基因療法主要通過(guò)直接殺傷作用和旁觀者效應(yīng)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。目前應(yīng)用最廣泛的是單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋(HSV-TK/GCV)和胞嘧啶脫氨基酶/5-氟胞

2、嘧啶(CD/5-Fc)兩大自殺基因體系,聯(lián)合應(yīng)用不僅可以提高療效、擴(kuò)大腫瘤治療譜,還能抑制繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生。
　　 而利用腫瘤特異性調(diào)控元件(啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)以驅(qū)動(dòng)自殺基因選擇性表達(dá)于特定的靶細(xì)胞中,能準(zhǔn)確殺傷腫瘤細(xì)胞,保護(hù)正常組織,減少毒副作用,這也是自殺基因臨床應(yīng)用的主要優(yōu)勢(shì)。因此,以KDR啟動(dòng)子(KDRp)驅(qū)動(dòng)自殺基因,可使自殺基因在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá),達(dá)到雙重靶向治療作用。
　　 近年來(lái),微泡造

3、影劑作為一種新型的基因載體,在超聲波的輻照下不僅能將裸質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)胞,還能提高轉(zhuǎn)染效率,被認(rèn)為是今后非病毒載體發(fā)展的重要方向。
　　 本項(xiàng)目擬應(yīng)用VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用研究,聯(lián)合使用超聲輻照微泡,觀察該系統(tǒng)在乳腺癌中的應(yīng)用效果,為進(jìn)一步開展自殺基因靶向治療乳腺癌的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：
　　 1.構(gòu)建乳腺癌移植瘤裸鼠模型(MCF-7體內(nèi)模型)。
　

4、　 2.超聲輻照微泡介導(dǎo)pEGFP-KDRp-CD/TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌裸鼠模型,觀察該治療系統(tǒng)對(duì)乳腺癌的體內(nèi)抑瘤作用。
　　 方法：
　　 建立乳腺癌移植瘤裸鼠模型,將20只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組,每組5只。Ⅰ組:空白對(duì)照組,僅給予前藥5-FC與GCV;Ⅱ組:僅注射裸質(zhì)粒與前藥5-FC與GCV;Ⅲ組:注射裸質(zhì)粒與前藥5-FC與GCV,并予超聲輻照;Ⅳ組:注射靶向超聲造影劑與前藥5-FC與GCV,并予超聲輻照。從處理開始當(dāng)

5、天起,每3天測(cè)量腫瘤大小,計(jì)算腫瘤的體積,觀察不同處理組的腫瘤生長(zhǎng)情況;處理結(jié)束后5天處死裸鼠,剝除腫瘤并稱重,計(jì)算各處理組與空白對(duì)照組相比較的抑瘤率;使用倒置熒光顯微鏡觀察目的基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染情況,并據(jù)此計(jì)算基因轉(zhuǎn)染率;RT-PCR法檢測(cè)目的基因的表達(dá);免疫組化法計(jì)數(shù)腫瘤的微血管密度。根據(jù)以上指標(biāo)了解腫瘤的生長(zhǎng)情況和目的基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染情況,從而評(píng)估超聲輻照微泡介導(dǎo)雙自殺基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤的體內(nèi)抑瘤作用。
　　 結(jié)果：

6、>　　 1.Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組處理組的抑瘤率分別為3.72％、21.40％、47.13％,同空白對(duì)照組(Ⅰ組)比較,裸質(zhì)粒組(Ⅱ組)的腫瘤大小較之Ⅰ組沒有明顯的差異(P＞0.05),而超聲輻照組(Ⅲ組)和超聲微泡聯(lián)合輻照組(Ⅳ組)的腫瘤大小較之Ⅰ組均有明顯的差異(P＜0.05),尤其以超聲微泡聯(lián)合輻照組的腫瘤的體積抑制最為顯著。
　　 2.Ⅳ組在超聲微泡的聯(lián)合作用下,其基因轉(zhuǎn)染的效率要明顯高于Ⅲ組超聲組,兩者比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

7、P＜0.001);超聲組與裸質(zhì)粒組比較,基因轉(zhuǎn)染效率稍高,但其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.Ⅲ組(超聲組)、Ⅳ組(超聲微泡組)的腫瘤組織中均出現(xiàn)了2415bp的CD/TK基因陽(yáng)性片段,而在Ⅰ組(空白對(duì)照組)、Ⅱ組(裸質(zhì)粒組)的腫瘤組織中未出現(xiàn)該陽(yáng)性片段。
　　 4.Ⅳ組在超聲微泡的聯(lián)合作用下,其對(duì)腫瘤血管的抑制作用要明顯高于Ⅲ組超聲組,兩者比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);Ⅲ組(超聲組)、Ⅳ組(超

8、聲微泡組)與空白對(duì)照組相比較,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);裸質(zhì)粒組與空白對(duì)照組比較,MVD計(jì)數(shù)稍低,但其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.皮下接種法建立裸鼠乳腺癌移植瘤動(dòng)物模型具有操作簡(jiǎn)單、模型穩(wěn)定、成功率高等優(yōu)點(diǎn),并且該模型能保持人乳腺癌腫瘤細(xì)胞的部分病理學(xué)特點(diǎn)及生物學(xué)特性;
　　 2.應(yīng)用MCF-7能成功的建立乳腺癌移植瘤裸鼠動(dòng)物模型,并能方便地觀測(cè)移植瘤的生長(zhǎng)情況;

9、r>　　 3.超聲輻照可提高裸鼠移植瘤組織的微血管通透性,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞,超聲輻照微泡則能更有效的介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)染,提高基因轉(zhuǎn)染率;
　　 4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因,荷瘤動(dòng)物腫瘤組織內(nèi)可以表達(dá)CD/TK融合基因的產(chǎn)物,聯(lián)合超聲輻照微泡,可以更有效的介導(dǎo)目的基因在腫瘤組織中表達(dá),使該治療系統(tǒng)具有滿意的體內(nèi)抑瘤作用.表現(xiàn)為對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制和腫瘤微血管密度的下降;
　　 5.超聲輻照微泡介導(dǎo)雙自殺基因系統(tǒng)是較理想的乳腺癌