腺病毒介導(dǎo)的ING4-p53雙基因治療乳腺癌的協(xié)同抑瘤效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討腺病毒介導(dǎo)的ING4/p53雙抑癌基因治療乳腺癌的療效及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.分別以pAdTrack-CMV/ING4質(zhì)粒和p53 ORF克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增ING4（BglII、SalI）和 p53（XhoI、XbaI）目的片段，分別亞克隆至 pAdTrack-CMV/polyA+hEF1a-eIF4g轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建pAdTrack-CMV/ING4/polyA+
　　hEF1a-eIF4g/p

2、53雙基因共表達(dá)重組轉(zhuǎn)移載體。
　　2.將構(gòu)建正確的 pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53重組轉(zhuǎn)移載體經(jīng)PmeI酶切后與pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，得到的同源重組質(zhì)粒 pAdEasy-1-pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53（簡(jiǎn)稱為pAd-ING4/p53）經(jīng)PacI酶切后再用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，

3、經(jīng)多輪感染、擴(kuò)增、純化后獲得AdVING4/p53雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體。
　　3.利用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）和建立裸鼠人乳腺癌皮下移植瘤模型檢測(cè)AdVING4/p53對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞體外、BALB/c裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。
　　4. Annexin V-PE/7-AAD雙染法流式細(xì)胞儀（FCM）和 TUNEL法分別檢測(cè)AdVING4/p53在體外、BALB/c裸鼠體內(nèi)誘導(dǎo)MDA-MB-231乳腺

4、癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　5. Western blot檢測(cè)AdVING4/p53對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞p53、乙?；痯53、P21、Bax、PUMA、Noxa、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3和PARP表達(dá)的影響；免疫組化檢測(cè)AdVING4/p53對(duì)BALB/c裸鼠MDA-MB-231乳腺癌皮下移植瘤p53、乙?；痯53、P21、Bax、PUMA、Noxa、Bcl-2、剪切型Caspase-3和CD31

5、表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了 pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和pAd-ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53同源重組腺病毒質(zhì)粒，及獲得了ING4和p53的雙基因共表達(dá)重組腺病毒AdVING4/p53。
　　2. AdVING4/p53有效地介導(dǎo)了 ING4和 p53在 HEK-293人胚腎細(xì)胞、MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中的

6、轉(zhuǎn)基因和共表達(dá)。
　　3.腺病毒介導(dǎo)的ING4和p53雙基因共表達(dá)（AdVING4/p53）在體外、BALB/c裸鼠體內(nèi)均能明顯抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡，并且具有協(xié)同效應(yīng)。
　　4. AdVING4/p53具有增強(qiáng)上調(diào) MDA-MB-231乳腺癌乙酰化 p53、P21、Bax、PUMA、Noxa、剪切型Caspase-9、剪切型Caspase-3、剪切型PARP和下調(diào)Bcl-2的效應(yīng)。
　　5.