UBE4B負性調控乳腺癌抑癌基因p53的蛋白水平.pdf

1、研究目的:
　　p53是目前哺乳動物中最為重要的抑癌基因之一，超過一半以上的人類癌癥中，p53都存在著突變或者缺失;UBE4B是近年來最新發(fā)現(xiàn)的E4泛素化因子，有研究證實，內源性UBE4B與p53和Hdm2存在相互作用，且能夠負性調控p53的功能和穩(wěn)定性。本文擬對乳腺癌中的UBE4B是否可以促進p53的泛素化和降解，進而抑制腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤的形成進行研究，以探討UBE4B是否有可能成為乳腺癌治療的新靶點。
　　研究方

2、法:
　　收集乳腺癌病例新鮮組織，westernblot觀察乳腺癌組織細胞及周圍正常乳腺組織細胞中UBE4B的蛋白水平，以及乳腺癌組織細胞中UBE4B和p53之間的蛋白水平關系，本課題使用乳腺癌細胞系MCF-7及SK-BR-3進行了泛素化實驗、免疫共沉淀實驗、凋亡實驗及裸鼠成瘤實驗等，最終證實在乳腺癌中UBE4B和p53存在著相互作用以及UBE4B可以負性調控p53的功能和穩(wěn)定性。
　　研究結果:
　　一、UBE4B和

3、p53在乳腺癌中的表達及UBE4B促進p53的泛素化水平
　　Westernblot結果顯示，在乳腺癌組織中，UBE4B的蛋白水平顯著高于乳腺癌周圍正常組織，而且乳腺癌組織中，UBE4B和p53的蛋白水平也基本呈負相關;在MCF-7細胞中，過表達UBE4B及Hdm2明顯促進了p53的泛素化水平。相反，當敲低細胞中UBE4B的蛋白表達后，p53的泛素化水平也隨之降低。相似的情況也可以在SK-BR-3細胞中觀察到。
　　二、UB

4、E4B和Hdm2及p53的體內相互作用
　　在MCF-7細胞中，免疫共沉淀實驗結果顯示，UBE4B與p53存在著相互作用;同樣，結果也顯示UBE4B與Hdm2也存在相互作用。實驗結果充分說明，在乳腺癌中，UBE4B與Hdm2和p53存在著體內相互作用。
　　三、UBE4B負性調控p53并且促進p53的降解
　　P53-/-的MCF-7細胞中，共同過表達p53、Flag-UBE4B以及Myc-Hdm2，p53的蛋白水平呈

5、現(xiàn)下調狀態(tài);相反，敲低細胞中的UBE4B和Hdm2，p53的蛋白水平呈現(xiàn)上升趨勢。在表達野生型p53的MCF-7細胞中梯度過表達UBE4B，p53呈現(xiàn)劑量依賴的下調的蛋白水平;我們分別將UBE4B-siRNA和con-siRNA轉入MCF-7細胞用以證實在乳腺癌中，UBE4B對于Hdm2介導的p53降解是必要的。
　　四、UBE4B抑制依賴于p53的細胞凋亡并且促進腫瘤的形成
　　為了證實這個結論，我們進行了細胞凋亡實驗，當

6、過表達UBE4B時，p53的蛋白水平呈現(xiàn)下降趨勢，且細胞凋亡的數量明顯減少，說明UBE4B抑制細胞凋亡;在共轉UBE4B-siRNA及Hdm2-siRNA的細胞中，細胞凋亡的數量明顯多于共轉UBE4B和Hdm2的細胞。為了進一步證實UBE4B對體內成瘤的效應，我們建立了裸鼠成瘤模型，分別給裸鼠皮下注射過表達UBE4B和空白載體的MCF-7細胞，結果顯示注射過表達UBE4B細胞的一側腫瘤生長速度明顯大于注射過表達空白載體的一側。