經(jīng)動脈灌注慢病毒介導的CD-TK基因轉(zhuǎn)染大鼠腹壁游離皮瓣治療乳腺癌的實驗研究.pdf

1、目的:
　　1、檢測慢病毒載體介導的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶/單純皰疹病毒胸苷激酶(CD/TK)雙自殺基因在大鼠乳腺癌SHZ-88細胞中的表達情況和對乳腺癌細胞的殺傷效應與旁觀者效應。
　　2、評估經(jīng)動脈灌注重組慢病毒轉(zhuǎn)染SD大鼠游離腹壁淺動脈穿支(SIEA)皮瓣后CD/TK基因在皮瓣內(nèi)的表達情況。
　　3、探討CD/TK雙自殺基因過表達慢病毒體系聯(lián)合前藥5-氟胞嘧啶與更昔洛韋(5-FC+GCV)對大鼠乳腺癌移植瘤生長的抑

2、制情況。
　　4、探討游離皮瓣在感染CD/TK雙自殺基因過表達慢病毒體系后是否會產(chǎn)生全身性的毒副反應。
　　方法:
　　1、將擴增后的載體質(zhì)粒（目的質(zhì)粒或空載質(zhì)粒）、慢病毒包裝質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T感受態(tài)細胞，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，將細胞上清液高速離心以濃縮純化病毒，將濃縮的慢病毒10倍梯度稀釋后感染HEK293T細胞，觀察細胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況，根據(jù)下列公式計算重組慢病毒的滴度:

3、病毒滴度=表達熒光蛋白的細胞數(shù)/病毒原液量。
　　2、分別將不同感染復數(shù)(MOI)的LV-CD/TK與LV-GFP重組慢病毒感染SHZ-88細胞，測定慢病毒對細胞的感染效率;采用CCK-8檢測感染慢病毒后SHZ-88細胞的生長曲線;通過RT-PCR與western blot檢測感染慢病毒體系后的SHZ-88細胞中CD/TK基因的表達情況;將不同濃度的5-FC與GCV單獨或聯(lián)合加入感染慢病毒后的SHZ-88細胞中，通過CCK-8與M

4、useTM CellAnalyzer檢測細胞的增殖、凋亡和周期的變化情況;將一定濃度的5-FC與GCV聯(lián)合加入感染慢病毒后的SHZ-88細胞中，隨后收集細胞上清，并加入到正常的SHZ-88細胞中，通過CCK-8檢測細胞的增殖情況。
　　3、解剖SD大鼠的SIEA皮瓣以了解局部血管的關(guān)系與走行;經(jīng)股動脈-腹壁淺動脈途徑灌注甲紫溶液以觀察腹壁淺動脈的供血范圍;將SHZ-88細胞接種于SIEA皮瓣的皮下，觀察皮瓣的成活情況以及移植瘤的生

5、長情況。
　　4、切取并游離SD大鼠的SIEA皮瓣，經(jīng)股動脈-腹壁淺動脈途徑灌注重組慢病毒溶液或PBS，體外孵育1h后原位移植SIEA皮瓣，術(shù)后第7天通過RT-PCR與western blot檢測CD/TK基因在SIEA皮瓣、受植創(chuàng)面與各臟器（心、肝、肺、腎、脾與小腸）中的表達情況。同上將重組慢病毒溶液或PBS經(jīng)動脈灌注SIEA皮瓣，原位移植皮瓣后，將SHZ-88細胞接種于SIEA皮瓣的皮下，術(shù)后30天內(nèi)每天經(jīng)腹腔注射前藥5-FC

6、+GCV，定期測量移植瘤體積，繪制生長曲線。每周抽取SD大鼠靜脈血檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）與天門冬氨基酸轉(zhuǎn)移酶(AST)水平的變化情況。術(shù)后第42天切取瘤體，稱重并計算抑瘤率，將瘤體與各臟器標本行HE染色觀察組織病理學變化。
　　結(jié)果:
　　1、CD/TK重組慢病毒的包裝與滴度測定:(1)將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞48h后，95％以上的細胞都表達綠色熒光蛋白，說明HEK293細胞對重組慢病毒的包裝過程順利，包

7、裝效果顯著。(2)測定病毒滴度，當病毒原液量為10-5μl時，CD/TK重組慢病毒組與空載慢病毒組中分別可見2個與1個帶綠色熒光的細胞，經(jīng)計算，CD/TK重組慢病毒與空載慢病毒的滴度分別為2E+8TU/ml與1E+8TU/ml。
　　2、CD/TK雙自殺基因聯(lián)合前藥對SHZ-88細胞的直接殺傷效應與旁觀者效應:
　　(1)CD/TK重組慢病毒對SHZ-88細胞的感染情況與空載慢病毒相似，隨著慢病毒MOI的增加，GFP陽性細胞

8、增加，熒光亮度增強，當MOI=100時，95％以上的細胞表達GFP，經(jīng)CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)MOI100以內(nèi)的病毒液對細胞生長無明顯影響;當MOI=200時，幾乎所有細胞表達GFP，但是病毒液對細胞有毒性，抑制細胞的生長。(2)通過RT-PCR與western blot檢測發(fā)現(xiàn)，感染LV-CD/TK的SHZ-88細胞中出現(xiàn)CD/TK融合基因mRNA水平與蛋白水平的表達，而感染LV-GFP或未感染病毒的SHZ-88細胞中未發(fā)現(xiàn)CD/TK基因的

9、表達。(3)實驗組的SHZ-88細胞對前藥5-FC+GCV具有較高的敏感性，細胞的存活率隨前藥濃度的增高而逐漸下降，呈劑量-效應關(guān)系(P＜0.001)，并且聯(lián)用前藥5-FC+GCV時，該組細胞的存活率明顯低于單用前藥GCV或5-FC時(P＜0.01);而陰性對照組與空白對照組的細胞生長未受明顯抑制。在給予前藥5-FC+GCV處理后，實驗組SHZ-88細胞的凋亡率以及細胞周期中處于G1期的比率均明顯高于陰性對照組與空白對照組的細胞(P＜0

10、.01)。(4)實驗組經(jīng)前藥5-FC+GCV處理后的細胞上清液可顯著抑制正常SHZ-88細胞的生長(P＜0.001)，而陰性對照組與空白對照組的細胞上清對正常SHZ-88細胞的生長無明顯影響。
　　3、SD大鼠SIEA皮瓣的血供系統(tǒng)與體內(nèi)的成瘤效果:(1)經(jīng)解剖SD大鼠SIEA皮瓣發(fā)現(xiàn)，股動脈自腹股溝處向外走行約1.4cm后可恒定發(fā)出腹壁淺動脈分支支配SIEA皮瓣。甲紫溶液經(jīng)股動脈-腹壁淺動脈途徑灌注后在SIEA皮瓣內(nèi)的分布范圍超

11、過2.5cm×2.5cm。(2)將SHZ-88細胞接種于SIEA皮瓣的皮下后，皮瓣成活良好，乳腺癌移植瘤生長速度平穩(wěn)。
　　4、CD/TK重組慢病毒灌注SIEA皮瓣聯(lián)合前藥對SD大鼠乳腺癌模型的療效觀察:(1)SD大鼠SIEA皮瓣經(jīng)動脈灌注病毒液或PBS后第7天，通過RT-PCR與western blot檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組SIEA皮瓣的蒂部、近蒂端與遠蒂端均有CD/TK融合基因mRNA水平與蛋白水平的表達，而陰性對照組與空白對照組的

12、皮瓣內(nèi)、實驗組的受植創(chuàng)面上以及各臟器（心、肝、肺、腎、脾與小腸）內(nèi)均未見CD/TK基因的表達。(2)SD大鼠的SIEA皮瓣經(jīng)動脈灌注病毒液或PBS，皮瓣皮下接種SHZ-88細胞，連續(xù)腹腔注射前藥5-FC+GCV30天后，各組中瘤體最終體積、最終瘤重與抑瘤率結(jié)果分別為:實驗組:104.00±7.53mm3，122.25±6.93mg，83.02％;陰性對照組:690.10±41.95mm3，693.56±26.91mg，3.70％;空白對

13、照組:706.57±21.22mm3，720.17±23.15mg，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)?？梢?，與陰性對照組、空白對照組相比較，實驗組的移植瘤生長受到明顯抑制;通過HE染色發(fā)現(xiàn)，實驗組的瘤體內(nèi)可見明顯的變性壞死灶，而陰性對照組與空白對照組的瘤體未見明顯變化。(3)定期抽取SD大鼠靜脈血檢測發(fā)現(xiàn)實驗組、陰性對照組與空白對照組血清中的ALT與AST水平在術(shù)后42天內(nèi)未見大幅度的波動。通過HE染色發(fā)現(xiàn)，實驗組的各臟器內(nèi)均無明顯的炎

14、性細胞的浸潤，也未發(fā)現(xiàn)SHZ-88大鼠乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　1、利用三質(zhì)粒包裝法可順利包裝CD/TK雙自殺基因過表達慢病毒體系以及空載慢病毒體系。
　　2、LV-CD/TK感染SHZ-88細胞后，CD/TK雙自殺基因可在細胞內(nèi)有效表達;CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合前藥5-FC+GCV可顯著殺傷SHZ-88大鼠乳腺癌細胞，有效誘導細胞凋亡，引起乳腺癌細胞周期G1期阻滯，并且在聯(lián)用前藥5-FC+GCV時對SH

15、Z-88細胞的殺傷效應明顯優(yōu)于單用前藥GCV或5-FC時，此外，CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合前藥5-FC+GCV對SHZ-88細胞可產(chǎn)生明顯的旁觀者效應。
　　3、SD大鼠的SIEA皮瓣具有穩(wěn)定的供血系統(tǒng)，腹壁淺動脈供血范圍超過2.5cm×2.5cm;SHZ-88大鼠乳腺癌細胞在SD大鼠SIEA皮瓣的皮下成瘤效果穩(wěn)定，重復性好。
　　4、LV-CD/TK可經(jīng)股動脈-腹壁淺動脈途徑灌注大鼠SIEA皮瓣，術(shù)后7天CD/TK雙自殺