靶向載PTX納米診療體超聲造影顯像及UTMD介導下體外抗胰腺癌治療的實驗研究.pdf

1、90％的胰腺癌為具有特殊組織結構的胰腺導管腺癌，癌組織缺乏功能正常的血管，且癌細胞分散在豐富的纖維間質組織中，抗癌藥物難以滲入來發(fā)揮作用,加之藥物的快速代謝導致化療藥物不敏感,而全身抗癌藥物的干預治療致使胰腺癌腫瘤局部治療低效能且全身副作用大，探索一種安全高效的給藥方式將為胰腺癌治療帶來新的契機。本研究內容是依托國家自然基金面上項目“可視化雙靶向載dFdC金納米微囊同步UTMD增強胰腺癌化療效果及瞬時成像的實驗研究”，以對人體無毒害作用

2、的生物可降解材料聚乳酸羥基乙酸－聚乙二醇(PLGA-mPEG）為骨架，將一線廣譜抗腫瘤藥物紫杉醇（PTX）包裹后，靶向胰腺癌高表達腫瘤標志物CA19-9及CEA，復乳法制備形成特殊的“多空穴”結構，探索超聲輻照微泡破裂（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）在增強靶向載藥“多空穴”納米微囊進入胰腺癌細胞的可行性，并進一步篩選UTMD的優(yōu)化條件，在實現特異性識別、黏附靶細胞并發(fā)揮

3、抗胰腺癌治療作用的同時，利用復合納米微囊本身獨特的內部“多空穴”特性來實現超聲造影增強顯像的實驗研究。本研究主要完成了靶向載藥納米診療體的制備和表征,體內外超聲造影顯像及體外抗胰腺癌治療的實驗部分。具體內容以三部分形式展開：
　　第一部分、靶向載PTX PLGA-mPEG納米診療體的制備與表征
　　目的：以生物可降解有機高分子共聚物PLGA-mPEG為骨架，構建靶向CA19-9，CEA，包裹 PTX的納米診療體。并對其粒徑分

4、布、大小形態(tài)、表面電荷及枝接抗體情況等理化特性進行表征，并檢測PTX包封率，載藥率及體外釋放規(guī)律。
　　方法：采用復乳法制備靶向載PTX的PLGA- mPEG“多空穴”納米診療體微囊，并通過設計多因素多水平的正交實驗對制備條件進行優(yōu)化，方差統計，最終得出最優(yōu)制備條件。超細微粒粒度及電位分析儀對所構建的靶向載 PTX納米診療體最大及平均粒徑分布及其表面所攜帶電荷進行表征，掃描電鏡檢測其大小、形態(tài)和分散度情況，紅外光譜檢測其枝接抗體情

5、況，在進一步對高效液相色譜法測定包封率及釋放率進行方法學驗證之后，檢測納米微囊對于PTX的包封率，載藥率及體外釋放規(guī)律，驗證納米微囊對于PTX的穩(wěn)定釋放功能，描記“時間-PTX體外釋放曲線”。
　　結果：通過正交實驗確定了制備PTX-mPEG-PLGA納米微囊4個因素(A:初乳乳化次數，B:PTX投藥比，C:油相體積，D:F-68濃度)對包封率及載藥率的影響程度，確定最佳制備工藝參數。復乳法最終成功制備靶向載PTX的PLGA-mP

6、EG“多空穴”納米微囊。粗測靶向納米診療體微囊的最大粒徑約為136.3±5.2nm，平均粒徑約為88.6±3.5nm，Zeta電位為-13.6±1.7mv，掃描電鏡證實anti-CA19-9-CEA-PTX-mPEG-PLGA靶向納米診療體微囊呈球形、表面光滑、分布均勻、無明顯團聚現象，觀測得到納米微囊粒徑在粗測得到的粒徑范圍之內。高效液相色譜法方法可靠，經測得PTX包封率為91.32±3.25%，載藥率為2.666±0.092%。納米

7、微囊在5天內可以持續(xù)穩(wěn)定的釋放PTX，累計釋放量達96％。紅外光譜法檢測納米微囊診療體所得光譜具有特征性的枝接抗體蛋白的光譜信息,間接證明微囊表面已修飾anti-CA19-9、anti-CEA抗體。
　　結論：復乳法可以成功制備anti-CA19-9-CEA-PTX-mPEG-PLGA靶向納米診療體，其本身具有獨特的“多空穴”結構，及良好的包封率、載藥率、靶向性及體外持續(xù)穩(wěn)定釋放 PTX功能，理論上能達到超聲造影增強顯像和靶向抗胰

8、腺癌治療的要求，為進一步的實驗打下了良好的前期基礎。
　　第二部分、靶向載PTX納米診療體體外及體內超聲造影增強顯像的實驗研究
　　目的：評估靶向載PTX納米診療體微囊體外及體內超聲造影增強顯像情況。
　　方法：彩色多普勒診斷超聲診斷儀Philips IE33，Siemens Sequaio512和LOGIQ E9（探頭L11-3，15L8W-S，ML6-14）。分為三組:第一組：5ml脫氣生理鹽水注入5ml塑料軟管并

9、封閉；84mg靶向載PTX納米診療體凍干粉放入5ml塑料軟管注入脫氣生理鹽水5ml并封閉，充分振搖；84mg SonoVue注入5ml脫氣生理鹽水并注入塑料軟管封閉,充分振搖；常規(guī)二維超聲及超聲造影模式下分別觀察3個軟管內顯像情況。第二組：0.5ml脫氣生理鹽水經兔耳緣靜脈快速注入,立即常規(guī)二維超聲及超聲造影模式下觀察兔腎臟顯像情況。84mg靶向載 PTX納米診療體凍干粉放入5ml塑料軟管注入脫氣生理鹽水5ml并封閉，充分振搖；84mg

10、 SonoVue注入5ml脫氣生理鹽水并注入5ml塑料軟管封閉,充分振搖；從每個軟管內各抽取0.5ml充分搖勻經兔耳緣靜脈快速注入,常規(guī)二維超聲及超聲造影模式下觀察兔腎臟顯像情況，記錄兔腎臟時間-強度曲線。第三組：0.2ml脫氣生理鹽水經裸鼠尾靜脈快速注入,立即常規(guī)二維超聲及超聲造影模式下觀察裸鼠胰腺癌體表種植瘤顯像情況。84mg靶向載PTX納米診療體凍干粉放入5ml塑料軟管注入脫氣生理鹽水5ml并封閉,充分振搖；84mgSonoVue

11、注入5ml脫氣生理鹽水并注入5ml塑料軟管封閉,充分振搖;之后分別各抽取0.2ml混懸液再次充分搖勻，經裸鼠尾靜脈快速注入,立即常規(guī)二維超聲及超聲造影模式下觀察裸鼠胰腺癌體表種植瘤顯像情況，并描記胰腺癌體表種植瘤時間-強度曲線。第四組：0.2ml脫氣生理鹽水經裸鼠尾靜脈快速注入,立即常規(guī)二維超聲及超聲造影模式下觀察裸鼠胰腺癌原位種植瘤顯像情況。84mg靶向載PTX納米診療體凍干粉放入5ml塑料軟管注入脫氣生理鹽水5ml并封閉，充分振搖；

12、84mg SonoVue注入5ml脫氣生理鹽水并注入5ml塑料軟管封閉,充分振搖；從軟管內各抽取0.2ml充分搖勻經裸鼠尾靜脈快速注入，立即常規(guī)二維超聲及超聲造影模式下觀察裸鼠胰腺癌原位種植瘤顯像情況，并描記胰腺癌原位種植瘤時間-強度曲線。
　　結果:
　　1.體外超聲造影增強顯像：常規(guī)二維模式：脫氣水呈現無回聲，SonoVue呈現粗點狀增強回聲，靶向載 PTX納米診療體呈現細點狀增強回聲。超聲造影模式：超聲造影顯像(和常規(guī)

13、二維模式比較)：脫氣水呈現無回聲，SonoVue呈現多量粗點狀增強回聲,靶向載PTX納米診療體呈現多量細點狀增強回聲,后兩者在超聲造影模式下顯像均較常規(guī)二維模式下偏強。
　　2.體內超聲對比增強顯像:(1)兔腎:脫氣生理鹽水在超聲造影模式下無對比增強顯像。載PTX納米診療體和SonoVue對于兔腎達到充盈高峰時兩者增強顯像效果均較好，動態(tài)造影過程：①靶向載PTX納米診療體混懸液注入后約5秒鐘開始充盈，24秒快速達到高峰之后維持約6

14、秒，約30秒時快速消退，到48秒開始緩慢消退，約8分鐘才基本完全消退。② SonoVue混懸液注入后約3秒鐘開始充盈，28秒快速達到高峰，之后維持約8秒，快速消退，約47秒時開始緩慢消退，在5分鐘之內基本消退完全。靶向載 PTX納米診療體達峰時間較SonoVue略提前，但峰值較SonoVue略偏低，消退較SonoVue減慢。(2)裸鼠胰腺癌體表種植瘤:脫氣生理鹽水在超聲造影模式下無對比增強顯像。靶向載PTX納米診療體和SonoVue對于

15、裸鼠胰腺癌體表種植瘤達到充盈高峰時兩者增強顯像效果均較好。動態(tài)造影過程：①靶向載 PTX納米診療體混懸液注入后瘤體約8秒快速充盈，從外周向中心向心性充盈，約33秒左右充盈完全，之后先快速消退，再緩慢消退，約10分鐘仍有散在星點狀回聲。② SonoVue混懸液注入后瘤體約5秒鐘開始充盈，從外周向中心呈向心性充盈，約35秒充盈達峰，維持大約6秒鐘，之后先快速消退，再緩慢消退，約9分50秒左右基本消退完全。靶向載PTX納米診療體和SonoVu

16、e在造影充盈過程中均呈快速充盈，達峰時間基本一致，充盈強度前者較后者略低一點，消退時納米診療體較SonoVue減慢，呈緩慢消退的過程，顯示納米診療體在瘤體中呈現明顯滯留時間延長。(3)裸鼠胰腺癌原位種植瘤:脫氣生理鹽水在超聲造影模式下無對比增強顯像。靶向載PTX納米診療體和SonoVue對于裸鼠胰腺癌原位種植瘤達到充盈高峰時兩者增強顯像效果均較好，且靶向載PTX納米診療體較SonoVue充盈強度更強，尤其對于原位瘤瘤體內的充盈。動態(tài)造影

17、過程:①靶向載 PTX納米診療體混懸液注入后周圍及中心約33秒同時開始充盈至70秒快速充盈達峰，之后開始消退，約150秒消退速度明顯減慢，至約10分鐘，原位瘤的強度仍約為1/3最大充盈強度，一直至約14分鐘，瘤體內仍有星點狀回聲未消退。②SonoVue混懸液注入后瘤體周圍及中心約30秒同時開始充盈，至60秒全部充盈，維持約8秒鐘，開始快速消退，約110秒消退速度減慢，至10分鐘接近消退完全。靶向載PTX納米診療體和SonoVue在造影充

18、盈過程中均呈快速充盈，達峰時間基本一致，充盈強度前者較后者略增強，消退時納米診療體較SonoVue減慢，呈緩慢消退的過程。
　　結論：靶向載PTX納米診療體和SonoVue在體外及兔腎、裸鼠胰腺癌體表及原位種植瘤超聲造影增強顯像效果均較好，靶向載PTX納米診療體較SonoVue消退時間明顯延長，在裸鼠體內胰腺腫瘤有明顯的滯留現象，相對延長了PTX在腫瘤等靶組織停留的時間，為今后抗腫瘤治療提供了一定的治療基礎。
　　第三部分、

19、優(yōu)化后UTMD促進靶向載PTX納米診療體體外抗胰腺癌的實驗研究
　　目的：
　　1.篩選增強納米微囊進入胰腺癌細胞的UTMD優(yōu)化條件。
　　2.有/無優(yōu)化UTMD作用下，不同時間點胰腺癌細胞對于納米微囊的攝取情況，觀察被動靶向、主動靶向、物理靶向及聯合靶向促進納米微囊進入胰腺癌細胞情況。
　　3.檢測納米材料及超聲/加微泡對于細胞的毒性作用。
　　4.UTMD介導靶向載PTX納米診療體殺死胰腺癌細胞的體外抗

20、腫瘤作用。
　　方法：
　　1.根據課題組前期工作基礎及文獻報道，設定20個篩選條件，將包載FITC的靶向納米微囊與CFAPC-1胰腺癌細胞共同孵育，即刻分別依次進行每個篩選條件的干預，干預完馬上觀察細胞狀態(tài)并且上機進行流式細胞學檢測，在細胞生長狀態(tài)良好的前提之下，篩選出胰腺癌細胞對于納米微囊的最大攝取率所對應的UTMD條件即最優(yōu)UTMD條件。
　　2.使用倒置熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡，流式細胞學檢測在優(yōu)化超聲條件

21、/加微泡作用下促進靶向/非靶向載RhB納米微囊進入胰腺癌細胞的情況。(1)被動及主動靶向性分組:①空白對照組:檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;②游離羅丹明組(RhB)：檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;③非靶向載RhB納米微囊組(NCs)：檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;④靶向載RhB納米微囊組(NCs-T):檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h。(2)物理及聯合靶向性分組：①單純游離Rh

22、B組：檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;②RhB+US組:檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;③RhB+UTMD組:檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;④單純非靶向包載RhB納米微囊(NCs)組：檢測4個時間點:6h，12h，24h，48h;⑤非靶向包載RhB納米微囊(NCs)+US組：檢測4個時間點:6h，12h，24h，48h;⑥非靶向包載RhB納米微囊(NCs)+UTMD組：檢測4個時間點:6h，1

23、2h，24h，48h;⑦單純靶向包載RhB納米微囊(NCs-T)組:檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;⑧靶向包載RhB納米微囊(NCs-T)+US組:檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h;⑨靶向包載RhB納米微囊(NCs-T)+UTMD組:檢測4個時間點：6h，12h，24h，48h。
　　3. MTT法檢測：不同條件下空納米微囊材料和胰腺癌細胞孵育24h，48h后細胞增殖情況，及優(yōu)化超聲/加微泡干預下24h，

24、48h后胰腺癌細胞增殖情況。具體分組：①單純PLGA-mPEG空白納米微囊24h組，② PLGA-mPEG空白納米微囊+ US24h組，③ PLGA-mPEG空白納米微囊+UTMD24h組，④單純PLGA-mPEG空白納米微囊48h組，⑤PLGA-mPEG空白納米微囊+US48h組，⑥PLGA-mPEG空白納米微囊+UTMD48h組，⑦PBS24h組，⑧SonoVue24h組4. CCK-8法檢測24h后，48h后不同分組條件下胰腺癌細

25、胞增殖情況。具體分組：(1)24h：①單純PTX組，②PTX+US組，③PTX+UTMD組，④單純PTX-NCs組，⑤PTX-NCs+US組，⑥PTX-NCs+UTMD組，⑦單純PTX-NCs-T組，⑧PTX-NCs-T+US組，⑨PTX-NCs-T+UTMD組，⑩空白對照組；(2)48h：①單純PTX組，②PTX+US組，③PTX+UTMD組，④單純PTX-NCs組，⑤PTX-NCs+US組，⑥PTX-NCs+UTMD組，⑦單純PTX

26、-NCs-T組，⑧PTX-NCs-T+US組，⑨PTX-NCs-T+UTMD組，⑩空白對照組
　　結果：
　　1.優(yōu)化UTMD條件篩選：超聲輻照功率/輻照時間/SonoVue體積比:1w/cm2/60s/40%條件下胰腺癌細胞攝取率最大為：39.67±2.45%。
　　2.靶向性驗證：
　　(1)被動靶向性：6h-12h-24h-48h:(RhB)組：隨時間推移，進入細胞快速，至12h達峰，之后細胞內熒光減退，逐

27、漸析出。游離RhB12h細胞攝取率在4個時間點中最高，較6h具有明顯統計學差異（P<0.05）。(NCs)組：隨時間推移，進入細胞緩慢增加，至48h達峰。(NCs)組：細胞48h攝取率在4個時間點中最高，較6h具有明顯統計學差異（P<0.05）。(NCs-T)組：隨時間推移，進入細胞緩慢增加，至48h達峰。NCs-T細胞48h攝取率在4個時間點中最高，較6h具有明顯統計學差異（P<0.05）。
　　(2)主動靶向性：6h：(RhB

28、)組：細胞攝取率4組中最高；(NCs)組：細胞攝取率較(RhB)組略低；(NCs-T)組：細胞攝取率較(NCs)組略高。12h：(RhB)組：細胞攝取率4組中最高；(NCs-T)組：細胞攝取率較(NCs)組高。24h：(RhB)組：細胞攝取率4組中最低；(NCs)組：細胞攝取率較(RhB)組高；(NCs-T)組：細胞攝取率較(NCs)組增高。48h后:(RhB)組：細胞攝取率4組中最低；(NCs)組：細胞攝取率較(RhB)組高；(NCs

29、-T)組：細胞攝取率較(NCs)組明顯增高，并具有統計學意義(P<0.05)。
　　(3)物理靶向性：各時間點，細胞對于納米微囊攝取率的影響，UTMD和US兩者較沒有US作用下細胞攝取率均增高，在6h，24h和48h為著，并均具有統計學意義(P<0.05)，UTMD和US比較，兩者在提高細胞攝取率上沒有明顯統計學差異(P>0.05)。
　　(4)聯合靶向性：(NCs-T)組較(NCs)組，細胞攝取率增高，以48h為著，而(N

30、Cs-T+US)組及(NCs-T+UTMD)組較(NCs-T)組各時間點細胞攝取率進一步增高，以12h，24h和48h為著,并具有統計學上顯著性差異(P<0.05)。
　　3.在PBS，SonoVue，空納米微囊，空納米微囊+優(yōu)化US條件，空納米微囊+優(yōu)化UTMD條件各組干預24h及48 h之下，胰腺癌細胞的增殖率均在90%之上，各組之間沒有明顯的統計學差異(P>0.05)。
　　4.CCK-8實驗驗證靶向載藥納米診療體體外

31、抗腫瘤效果：
　　(1) PTX裸藥組、PTX-NCs組、PTX-NCs-T組三組，在分別與胰腺癌細胞孵育24h和48h之后，每組細胞存活率隨藥物濃度的增加，逐漸呈下降趨勢。
　　(2)PTX裸藥組在48h細胞存活率較24h每個對應濃度降低，但降低幅度較小，PTX-NCs組及PTX-NCs-T組48h細胞存活率較24h每個對應濃度降低，但降低幅度較大，和PTX裸藥組比較有統計學意義（P<0.05）。
　　(3) PTX

32、裸藥組、PTX-NCs組、PTX-NCs-T組三組分別在US及UTMD干預之下，每組細胞存活率隨載藥物濃度的增加，均呈逐漸下降趨勢。
　　(4)分別在24h和48h，PTX-NCs+US組及PTX-NCs+UTMD組較單純PTX-NCs組細胞存活率對應濃度有較大幅度下降（P<0.05）；PTX-NCs-T+US組及PTX-NCs-T+UTMD組較單純PTX-NCs-T組細胞存活率對應濃度有較大幅度下降（P<0.05）。
　　

33、(5)分別在24h和48h，PTX-NCs+US組及PTX-NCs+UTMD組兩組間對應濃度細胞存活率無顯著性差異。（P>0.05）；PTX-NCs-T+US組及PTX-NCs-T+UTMD組兩組間對應濃度細胞存活率無顯著性差異。（P>0.05）。
　　結論：
　　1.優(yōu)化的US及UTMD條件下，可以在保證細胞存活率的前提下，有效促進靶向納米微囊進入胰腺癌細胞。
　　2.
　?、賀hB在24h之后隨時間推移而進入

34、細胞逐漸減少，可能因為小分子量的染料分子可以自由進出細胞膜，所以隨時間推移，進入細胞的一部分又從細胞內游弋出來。而非靶向載PTX納米微囊因其足夠小巧的粒徑具有被動靶向的功能，從而隨時間的延長而持續(xù)地進入細胞增多。靶向載 PTX納米微囊較非靶向納米微囊進入細胞增多，和靶向的抗原-抗體尋靶結合有一定關系，且無論是靶向還是非靶向納米微囊的粒徑相對于羅丹明染料分子來說大很多，不易從細胞內游弋出來。這與納米微囊在之前裸鼠體內顯像的停留時間延長相一

35、致。
　?、赨S及UTMD可以明顯增強靶向及非靶向納米微囊進入細胞，除與“聲孔效應”直接相關，可能還和其他一些廣泛研究的不完全明了的一些機制有關.
　?、鄱鳸S和UTMD對于促進納米微囊進入細胞內部的效能比較接近，是否和超聲輻照作用之下形成可逆性聲孔的飽和度相關。
　　3.MTT試驗結果顯示PLGA-mPEG材料、優(yōu)化的US、優(yōu)化的UTMD作用下細胞存活率基本在90%以上，表明所使用PLGA-mPEG材料、SonoVu