腺病毒介導(dǎo)NK4基因傳染間充質(zhì)干細(xì)胞靶向治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　基因治療被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療和化療等治療方法之后最有前景的腫瘤治療方案之一。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體即HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，其生物學(xué)活性對(duì)腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管形成有促進(jìn)作用。NK4是HGF的新型拮抗劑，其可以通過與HGF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合c-Met抑制HGF介導(dǎo)的c-Met酪氨酸磷酸化。NK4還可以抑制腫瘤進(jìn)展、血管生成等，并能聯(lián)合其它方式發(fā)揮治療腫瘤的作用。腺病毒是基因傳遞和

2、表達(dá)常用載體，由于腺病毒有高度穩(wěn)定性、高滴度、不會(huì)整合和插入突變的諸多優(yōu)點(diǎn)而被視為病毒感染的首選載體。但是病毒載體經(jīng)常在發(fā)揮生物學(xué)作用之前便在循環(huán)中損失較多的有效病毒滴度，所以設(shè)想考慮選擇一種具有腫瘤趨向性的運(yùn)載工具，能夠輸送重組病毒基因直接到達(dá)腫瘤所在的位置，釋放活性因子從而發(fā)揮抗腫瘤作用。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)則確實(shí)具有腫瘤趨向性的特點(diǎn)，以其作為載體，通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)觀察NK4治療胰腺

3、癌的作用，最大限度減少腺病毒對(duì)其他臟器的副作用，為該病的治療提供新思路。因此，本研究將探討腺病毒介導(dǎo)的NK4感染間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌生物學(xué)功能、分子機(jī)制及治療作用，為胰腺癌的治療提供新的思路。
　　方法:
　　首先在臨床胰腺癌標(biāo)本中檢測(cè)c-Met和CD105的表達(dá)，探討二者的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系，以及c-Met過表達(dá)與CD105的相關(guān)性，初步證實(shí)c-Met在胰腺癌中的過表達(dá)和胰腺癌的侵襲性表現(xiàn)呈正相關(guān)，為下一步繼續(xù)

4、實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。然后體外分離培養(yǎng)和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和培養(yǎng)胰腺癌SW1990細(xì)胞，構(gòu)建含有EGFP的NK4重組腺病毒載體Ad-NK4/EGFP并測(cè)定病毒滴度。用此腺病毒感染BMSCs，構(gòu)建BMSCs負(fù)載NK4重組腺病毒載體(Ad-NK4/EGFP-BMSCs)，分別應(yīng)用WB、RT-PCR及ELISA的方法通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察Ad-NK4/EGFP-BMSCs對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、周期和侵襲能力的影響及其聯(lián)合吉西他

5、濱抑制裸鼠皮下腫瘤的增長(zhǎng)及腹腔腫瘤細(xì)胞的種植，抑制腫瘤增殖和新生血管表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤凋亡的作用，來闡述其相互關(guān)系，探討其作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.c-Met在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率為61.5％， c-Met和CD105的表達(dá)與患者的年齡、性別和腫瘤大小無關(guān)(p＞0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及臨床分期之間的表達(dá)差異有顯著性(p＜0.05)。胰腺癌組織c-Met表達(dá)與CD105表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.分離的BMSCs經(jīng)過培養(yǎng)、鑒定發(fā)現(xiàn)符合骨髓間充質(zhì)的特點(diǎn)包括細(xì)胞的增殖和周期特點(diǎn)、能夠誘導(dǎo)形成脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞等。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29和CD90陽性表達(dá);
　　3.結(jié)果表明成功構(gòu)建腺病毒rAd-NK4/EGFP載體及相應(yīng)的對(duì)照病毒rAd/EGFP，并篩選了最佳的病毒感染復(fù)數(shù)和作用時(shí)間。用該腺病毒感染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞后能夠檢測(cè)到NK4的表達(dá)。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染rAd-NK4/EGFP-BMSCs能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成，具有顯著誘導(dǎo)凋亡效果，對(duì)胰腺癌細(xì)胞集落形成具有分散作用和促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲(p＜0.05)。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ad-NK4/EGFP-BMSCs、單用吉西他濱和聯(lián)合吉西他濱治療組均能延緩胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。免疫組化研究顯示Ad-NK4/EGFP-BMSCs組CD105和VEGF表達(dá)顯著降低，與吉西他濱聯(lián)合后其表

8、達(dá)下降更顯著(p＜0.05)，而PCNA的表達(dá)各組間無顯著性(p＞0.05)。熒光顯微鏡下觀察，腫瘤組織及其他臟器均沒有熒光。
　　結(jié)論:
　　利用腺病毒構(gòu)建重組Ad-NK4感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作用于胰腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這種方法在體外和體內(nèi)均能一定程度地抑制胰腺癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，經(jīng)過處理的BMSCs仍具有一定腫瘤組織趨向性，說明BMSCs作為腫瘤基因治療負(fù)載體系具有相當(dāng)?shù)目尚行?，尤其是在?lián)合應(yīng)用臨床抗腫瘤