Pegfp-N2-BMP2轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞誘導(dǎo)向心肌分化.pdf

1、目的：心肌梗死是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，心肌梗死后功能性心肌細(xì)胞丟失和疤痕組織形成使存活的心肌細(xì)胞減少、繼發(fā)心室重構(gòu)，是造成心肌梗死患者發(fā)生心力衰竭甚至死亡的重要原因。人體內(nèi)心肌細(xì)胞不能再生，損傷的心肌細(xì)胞不能修復(fù)和分化，故臨床藥物治療、介入治療不能逆轉(zhuǎn)已壞死的心肌，無法促使梗死的心肌再生，使心肌梗死患者的遠(yuǎn)期預(yù)后不能得到顯著改善。而心臟移植由于手術(shù)復(fù)雜、供體來源困難和費用高等原因，在臨床很難推廣。治療心肌梗死的關(guān)鍵是增加梗塞區(qū)內(nèi)功

2、能性心肌細(xì)胞的數(shù)量，目前，細(xì)胞移植治療正成為一種新的治療方法。因此，尋找可代替死亡細(xì)胞的合適的種子細(xì)胞來防治心肌梗死后的心衰、心室重構(gòu)，改善心功能，是近年來研究的主要問題。
　　 骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族至少包括40個成員，至今已鑒定了的BMP有15種之多，都屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族，以功能域的同源性為基

3、礎(chǔ)，它又分成幾個BMP超家族，即BMP-2、4超家族，BMP-5、6、7、8超家族，生長分化因子-5(growth and differentiationfactor,GDF-5)、GDF-6(BMP-13)、GDF-7(BMP-12)超家族，以及BMP-3與GDF-10(BMP-3b)超家族。其中，BMP-2、4超家族具有很高的生物活性，有研究表明BMP-2、4參與調(diào)控心臟發(fā)生和心肌分化過程。對雞胚的研究證實，在早期雞胚的心臟發(fā)育部位

4、，能夠檢測到BMP2的表達(dá)。另有研究表明外源加入BMP2蛋白可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞，且有資料表明BMP信號途徑是心臟早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、NKx2.5上游效應(yīng)分子。此類研究表明，BMP2在胚胎時期的心臟發(fā)育、心肌分化中起著非常重要的作用，但是BMP2在心肌分化中的作用機(jī)制，尤其是與心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如NKx2.5、GATA-4等之間的相互作用國內(nèi)外未見報道，另外，外源表達(dá)BMP2基因能否高效誘導(dǎo)P19細(xì)胞心肌分化亦未見報

5、道。因此本實驗選用BMP2基因轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞，觀察其誘導(dǎo)心肌分化的作用。
　　 P19胚胎瘤細(xì)胞(P19 embryonal carcinoma cells，P19ECCs)是從C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分離得到，可以在體外迅速大量擴(kuò)增，多次傳代也不喪失其分化能力。P19細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，可分化為內(nèi)胚層、中胚層、外胚層3個胚層的不同類型的細(xì)胞。在體外不同的誘導(dǎo)條件下可被誘導(dǎo)為包括心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及神經(jīng)元在內(nèi)的多種類型的細(xì)胞

6、，因而是一種較為理想的用于研究細(xì)胞分化和發(fā)育的工具細(xì)胞，如果在體外誘導(dǎo)向心肌分化后進(jìn)行移植，可能成為較理想的替代壞死心肌的種子細(xì)胞。因此，P19細(xì)胞常作為研究心臟發(fā)育和心肌分化的一個良好體外模型。但在P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中細(xì)胞聚集體的形成和誘導(dǎo)劑的結(jié)合是兩個必需條件，目前尚沒有明確的資料證明P19細(xì)胞在單層培養(yǎng)的情況下可以向心肌細(xì)胞分化。因此，缺少這兩個條件之一，P19細(xì)胞不能向心肌細(xì)胞分化。
　　 本課題擬將BMP2

7、基因轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞，聚集培養(yǎng)后，觀察其在沒有誘導(dǎo)劑的情況下向心肌分化的情況。并研究在二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide DMSO)的作用下，穩(wěn)定表達(dá)BMP2的P19細(xì)胞在單層培養(yǎng)時向心肌分化的情況，為P19細(xì)胞有效轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞探索一個比較好的誘導(dǎo)方式，為心肌梗死的細(xì)胞移植治療探索一個合適的種子細(xì)胞。
　　 方法：
　　 1.pEGFP-N2-BMP2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　 以pEFSA-B

8、MP2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出BMP2的序列，上游引物：5’-GCCAGATCTAAAGGTCGACCATGGT-3′，引入酶切位點BglⅡ；下游引物：5′-TTAGAATTCGCGACACCCACAACC-3′，引入酶切位點EcoRⅠ。反應(yīng)完畢后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化靶片斷。將條帶單一的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，小劑量膠回收試劑盒回收，并用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切純化BMP2 DNA。限制性內(nèi)切

9、酶BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切pEGFP-N2載體并純化。將PCR擴(kuò)增的BMP2 DNA與雙酶切后的pEGFP-N2經(jīng)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于固體LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16-24h；挑取單個陽性菌落，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR鑒定有無目的片段，再經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定、測序鑒定。
　　 2.pEGFP-N2-BMP2轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞后聚集培養(yǎng)誘導(dǎo)向心肌分化<

10、br>　　 實驗分實驗組和對照組。實驗組為轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-BMP2的P19細(xì)胞，轉(zhuǎn)染之前通過預(yù)實驗確定合適的細(xì)胞接種密度，轉(zhuǎn)染最佳體系，G418篩選濃度。本實驗采用陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將質(zhì)粒pEGFP-N2-BMP2轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞，轉(zhuǎn)染之后24h將細(xì)胞按1×105/ml密度傳代，G418穩(wěn)定篩選14天后，將篩出細(xì)胞聚集培養(yǎng)4天形成聚集體，聚集體移入培養(yǎng)皿中貼壁生長。在貼壁的4天、8天、12天、16天取

11、細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和心肌肌動蛋白α(α-cardiac actin)的表達(dá)；RT-PCR檢測GATA-4、NKx2.5兩個基因的表達(dá)；Western blot檢測α-cardiac actin和cTnT蛋白的表達(dá)。并取貼壁16天的細(xì)胞透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。對照組將P19細(xì)胞直接聚集培養(yǎng)，觀察細(xì)胞分化的情況，對照組取材時間和檢測指標(biāo)同實驗組。
　　 3.

12、DMSO誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-BMP2的P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時向心肌分化
　　 實驗分為實驗組和對照組，實驗組為轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-BMP2質(zhì)粒的P19細(xì)胞，DMSO誘導(dǎo)單層細(xì)胞培養(yǎng)，對照組為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的P19細(xì)胞，DMSO誘導(dǎo)單層細(xì)胞培養(yǎng)。兩組均在誘導(dǎo)的4天、8天、12天、16天取細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測α-cardiac actin和cTnT的表達(dá)；RT-PCR檢測GATA-4、NKx2.5兩個基因的表達(dá)；Western

13、blot檢測α-cardiac actin和cTnT蛋白的表達(dá)。并取貼壁16天的細(xì)胞做透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.pEGFP-N2-BMP2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　 以pEFSA-BMP2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出約1.2kb的基因片段，與BMP2基因編碼框(1191bp)大小一致。經(jīng)BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切分別得到帶有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點的約1.2kb的BMP2基因片

14、段和4.7kb的pEGFP-N2載體，然后回收、連接轉(zhuǎn)化后，篩出新生菌落。進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示從重組質(zhì)粒中可擴(kuò)增出大小約1.2kb的基因片段。所提質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后，可獲得約1.2kb和4.7kb的條帶，分別與BMP2基因(1191bp)和載體pEGFP-N2(4.7kb)的大小一致。用啟動子CMV引物進(jìn)行測序，測序結(jié)果校對后經(jīng)BLAST分析，表明此核酸序列與GeneBank中BMP2 mRNA序列(NM-001

15、200)的編碼序列完全吻合，酶切位點完整，說明已將BMP2基因編碼框正確插入pEGFP-N2載體的多克隆位點(MCS)。確定在本實驗中，pEGFP-N2-BMP2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.pEGFP-N2-BMP2轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞后聚集培養(yǎng)誘導(dǎo)向心肌分化
　　 通過反復(fù)實驗確定：細(xì)胞傳代密度：2×105/ml，轉(zhuǎn)染比率1:2.5，G418穩(wěn)定篩選濃度：600μg/ml。實驗組在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N2-BMP2之后的1

16、8-24h可見部分細(xì)胞表達(dá)EGFP-BMP2融合蛋白，G418篩選2周后，大多數(shù)細(xì)胞可觀察到綠色熒光，這些細(xì)胞為穩(wěn)定表達(dá)BMP2的P19細(xì)胞。實驗組和對照組的細(xì)胞在軟瓊脂糖培養(yǎng)基內(nèi)懸浮培養(yǎng)4天形成聚集體，將聚集體接種到培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞由周邊爬出，細(xì)胞胞體變大變長，伸出突起相連在一起。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：實驗組細(xì)胞貼壁培養(yǎng)4天時，α-cardiac actin和cTnT都不表達(dá)，第8天的時候，兩種蛋白均有表達(dá)，但是表達(dá)量較少，12天和

17、16天的表達(dá)量逐漸增多，陽性反應(yīng)產(chǎn)物分布在細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)棕黃色，隨著時間的延長，細(xì)胞中出現(xiàn)明顯棕黃色束狀結(jié)構(gòu)。陽性細(xì)胞吸光度值統(tǒng)計結(jié)果顯示：兩種蛋白表達(dá)量8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01），其他天數(shù)間比較也有顯著差異(P＜0.01)。對照組沒有檢測到兩種蛋白的陽性表達(dá)。RT-PCR結(jié)果：實驗組GATA-4和Nkx2-5在貼壁培養(yǎng)的4天開始有表達(dá)，但表達(dá)量較弱，8天、12天和16天表達(dá)逐漸增多，統(tǒng)計結(jié)果顯示：GATA

18、-4和NKx2.5的表達(dá)4天、8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數(shù)間比較也有顯著差異（P＜0.01）。對照組沒有檢測到兩種基因的陽性表達(dá)。Western Blot結(jié)果：實驗組細(xì)胞，α-cardiac actin和cTnT兩種蛋白在4天沒都有表達(dá)，在8天的時候有表達(dá)，12天和16天時表達(dá)量逐漸增高。統(tǒng)計結(jié)果顯示：兩種蛋白的表達(dá)8天、12天、16天與對照組比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，其他天數(shù)間比較也有統(tǒng)計學(xué)

19、差異(P＜0.01）。對照組細(xì)胞兩種蛋白均沒有表達(dá)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組的細(xì)胞經(jīng)聚集、貼壁培養(yǎng)16天后，細(xì)胞胞質(zhì)中可見較多的高爾基復(fù)合體、游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器，在一些細(xì)胞的胞質(zhì)中，可見平行排列的肌絲樣結(jié)構(gòu)；相鄰細(xì)胞分化出細(xì)胞連接，細(xì)胞連接的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)肌絲樣結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)。對照組未發(fā)現(xiàn)分化的細(xì)胞。
　　 3.DMSO誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-BMP2的P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時向心肌分化
　　 在D

20、MSO誘導(dǎo)時，隨著誘導(dǎo)時間延長，實驗組和對照組細(xì)胞均有聚集生長的趨勢，生長緩慢。兩組細(xì)胞在培養(yǎng)過程中都沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞跳動現(xiàn)象。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：實驗組細(xì)胞α-cardiac actin和cTnT在4天的時候都沒有表達(dá)，在8天、12天、16天時均有表達(dá)，并隨時間延長而逐漸增高，細(xì)胞中棕黃色成束絲樣結(jié)構(gòu)增多。陽性細(xì)胞吸光度值統(tǒng)計結(jié)果顯示：兩種蛋白在8天、12天、16天的表達(dá)量與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數(shù)間比較也有顯著差異(

21、P＜0.01)。對照組細(xì)胞在DMSO誘導(dǎo)的4天、8天、12天、16天均沒有檢測到α-cardiac actin和cTnT的陽性表達(dá)。RT-PCR結(jié)果：實驗組，穩(wěn)定表達(dá)BMP2的P19細(xì)胞在DMSO誘導(dǎo)下、單層培養(yǎng)后，GATA-4和NKx2.5在第4天開始有表達(dá)，但表達(dá)量較弱，8天、12天、16天表達(dá)逐漸增多。統(tǒng)計結(jié)果表明：GATA-4的表達(dá)4天、8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數(shù)間比較也有顯著差異(P＜0

22、.01或P＜0.05);NKx2.5的表達(dá)4天、8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數(shù)間比較除12天與16天無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)外也均有顯著差異(P＜0.01)。在對照組，各時間點均未檢測到兩種基因的陽性表達(dá)。Western Blot結(jié)果：實驗組，穩(wěn)定表達(dá)BMP2的P19細(xì)胞在DMSO誘導(dǎo)下、單層培養(yǎng)后，α-cardiac actin和cTnT在4天都沒有表達(dá)，在8天的時候開始有表達(dá)，12天和16天時

23、表達(dá)逐漸增多。統(tǒng)計結(jié)果顯示：α-cardiac actin在4天、8天、12天、16天與對照組比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01或P＜0.05)，其他天數(shù)間比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。cTnT在8天的時候有表達(dá)，但與對照組比沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，其他天數(shù)間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。對照組細(xì)胞兩種蛋白均沒有表達(dá)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組細(xì)胞胞質(zhì)中可見較多的高爾基復(fù)合體、游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器，在一些細(xì)胞

24、的胞質(zhì)中，可見平行排列的肌絲樣結(jié)構(gòu)；相鄰細(xì)胞分化出細(xì)胞連接，細(xì)胞連接的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)微絲樣結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)。對照組未發(fā)現(xiàn)分化的細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實驗成功構(gòu)建了pEGFP-N2-BMP2真核表達(dá)質(zhì)粒，為以后研究BMP2基因的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.本實驗將pEGFP-N2-BMP2真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞，可見其在P19細(xì)胞中表達(dá)，因此，pEGFP-N2-BMP2真核表達(dá)質(zhì)?？梢杂糜谡婧思?xì)胞

25、的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選。
　　 3.轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pEGFP-N2-BMP2的P19細(xì)胞不需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)，只聚集培養(yǎng)即可分化為心肌樣細(xì)胞，表達(dá)心臟早期轉(zhuǎn)錄因子、心肌特異基因和心肌特異蛋白，在基因和蛋白水平表達(dá)心肌源性細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。結(jié)果表明外源表達(dá)BMP2基因可以誘導(dǎo)P19細(xì)胞在沒有誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時即向心肌分化，為P19細(xì)胞有效轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞探索了一個比較好的誘導(dǎo)方式。
　　 4.轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pEGFP-N2-BMP2的P19細(xì)胞

26、不需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)，只聚集培養(yǎng)即可分化為心肌樣細(xì)胞，表明BMP2基因在P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中具有促心肌分化作用，說明BMP信號在P19細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。
　　 5.DMSO誘導(dǎo)使單層培養(yǎng)的穩(wěn)定表達(dá)BMP2基因的P19細(xì)胞向心肌分化，表達(dá)心臟早期轉(zhuǎn)錄因子、心肌特異基因和心肌特異蛋白，在基因和蛋白水平表達(dá)心肌源性細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，表明BMP2基因可以促進(jìn)P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時向心肌細(xì)胞分化，進(jìn)一步說