P19細(xì)胞向心肌分化及其移植改善心肌梗死大鼠心功能的研究.pdf

1、目前在世界范圍內(nèi)，充血性心力衰竭發(fā)病率的增加已成為心臟疾病中的主要問(wèn)題，而心衰的主要原因是冠心病心肌梗死。近20年來(lái)醫(yī)學(xué)界一直在不斷地改善和提高治療技術(shù)和手段。然而，現(xiàn)在的藥物療法和手術(shù)療法還存在很多不足，雖然溶栓和急診經(jīng)皮腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)等血管重建技術(shù)，可以使急性心肌梗死的梗死區(qū)早期再灌注，減少梗死面積，保護(hù)心功能，提高患者生存率，但不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)壞死的心肌；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑及β-受體阻滯劑等藥物可以使心力衰竭患者

2、的預(yù)后得以改善，但是并不能改變心肌細(xì)胞數(shù)量減少；心臟移植雖然可以替代受損心臟，但因供體有限，難以廣泛推廣應(yīng)用。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用細(xì)胞移植方法來(lái)修復(fù)受損心臟，對(duì)心肌進(jìn)行重建治療，改善心功能已成為可能。這一療法對(duì)充血性心力衰竭的治療具有重要意義，并有巨大的發(fā)展前途。目前對(duì)該療法研究的焦點(diǎn)問(wèn)題是：(1)細(xì)胞的選擇。選擇適宜的移植細(xì)胞類型至關(guān)重要，哪一種細(xì)胞效果更好，目前還缺乏系統(tǒng)的研究。(2)用于移植的動(dòng)物模型。目前所用的動(dòng)物

3、心肌缺血模型多通過(guò)對(duì)其心肌冷凍損傷、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎或栓塞，其在一定程度上模擬心肌梗死，但與臨床冠心病的病理改變還不盡相同，更接近動(dòng)脈硬化的心肌梗死模型還有待進(jìn)一步探討。(3)植入的細(xì)胞生存和繼續(xù)增殖多長(zhǎng)時(shí)間，在完全分化后是否還會(huì)行使功能。(4)臨床研究中的移植細(xì)胞示蹤和分化鑒定問(wèn)題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的標(biāo)記物對(duì)供體細(xì)胞和受體都有一定的毒性，必須找到對(duì)人體無(wú)害又便于跟蹤的標(biāo)記物。(5)移植細(xì)胞的合適數(shù)量目前尚難確定，因?yàn)楦鞣N細(xì)胞的增殖分化能力不

4、同。干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞移植治療心肌梗死，是未來(lái)治療心肌梗死和心力衰竭的策略和方向。但是，這一方法要應(yīng)用于臨床還很遙遠(yuǎn)，臨床應(yīng)用之前還應(yīng)全面了解干細(xì)胞的生物學(xué)特性，分化機(jī)制和條件，以及干細(xì)胞如何在梗死疤痕組織中分化和再生成心肌細(xì)胞，再生的心肌細(xì)胞如何才能與移植存活的心肌發(fā)生功能上的整合，如興奮收縮耦聯(lián)和機(jī)械收縮的協(xié)調(diào)一致，從而在功能上代替丟失的心肌細(xì)胞，如何才能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)干細(xì)胞的在體分化等諸多問(wèn)題。P19胚性癌細(xì)胞是加拿

5、大渥太華大學(xué)McBerney等在1982年從雄性小鼠畸胎瘤中分離得到的，是一種能在體外培養(yǎng)增殖、分化的多能干細(xì)胞，在一定濃度二甲基亞砜(DMSO)的誘導(dǎo)下，可以向心肌細(xì)胞分化。P19細(xì)胞是一種具有類似于胚胎干細(xì)胞的特性而又優(yōu)于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞：第一，它來(lái)源于動(dòng)物畸胎瘤，不涉及倫理問(wèn)題；第二，它是一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)室中容易獲得；第三，它具有正常小鼠二倍體核型，細(xì)胞分裂快，可在體外迅速大量擴(kuò)增，多次傳代也不喪失其分化能力，易于得到移植所

6、需的細(xì)胞數(shù)量；第四，因其為胚胎來(lái)源，免疫原性較弱?；谝陨咸攸c(diǎn)，本研究對(duì)P19細(xì)細(xì)胞在體外和體內(nèi)向心肌分化進(jìn)行觀察，并選用P19細(xì)胞作為移植細(xì)胞觀察移植到冷凍損傷的大鼠心肌疤痕組織后，其心功能的改善情況。本實(shí)驗(yàn)共分三個(gè)部分。 方法與結(jié)果1DMSO體外誘導(dǎo)P19細(xì)細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化 將P19細(xì)胞在體外DMSO誘導(dǎo)條件下向心肌樣細(xì)胞分化。P19細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代，用含5％、10％、15％3種不同濃度胎牛血清的培養(yǎng)液，同時(shí)進(jìn)行

7、培養(yǎng)，觀察哪一種濃度胎牛血清對(duì)P19細(xì)胞聚集體形成更好。P19細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代，在體外用1％DMSO誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化。分化的P19細(xì)胞經(jīng)HE染色及心肌標(biāo)志物GATA-4、Connecxin43、α-sarcomericactin的免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，在光鏡、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：(1)3種不同濃度胎牛血清的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞聚集體形成率的比較：含15％和10％胎牛血清培養(yǎng)液細(xì)胞聚集體形成

8、率比含5％胎牛血清的培養(yǎng)液高，差異顯著(P＜0.05)。含10％胎牛血清的培養(yǎng)液和含15％胎牛血清的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞聚集體形成率比較，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。(2)經(jīng)DMSO誘導(dǎo)分化后4d有細(xì)胞聚集體形成，6d有部分細(xì)胞GATA-4和Connecxin43呈陽(yáng)性表達(dá)，GATA-4陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，Connecxin43陽(yáng)性表達(dá)呈斑點(diǎn)狀分布于心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞膜表面。10d時(shí)GATA-4和Connecxin43陽(yáng)性表達(dá)明顯

9、增加，并有部分細(xì)胞呈α-sarcomericactin陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)。電鏡觀察，未分化細(xì)胞細(xì)胞體小，細(xì)細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞器不發(fā)達(dá)；誘導(dǎo)后6d，細(xì)胞間出現(xiàn)緊密連接和中間連接，細(xì)細(xì)胞質(zhì)增多，部分細(xì)胞表面出現(xiàn)突起，突起內(nèi)可見(jiàn)微絲。誘導(dǎo)后10d，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體豐富，并有肌絲形成。以上表明P19細(xì)胞在DMSO誘導(dǎo)下已有向心肌分化趨向，有類似胚胎心肌細(xì)胞形成。 2P19細(xì)胞在體內(nèi)心肌環(huán)境

10、中向心肌細(xì)胞分化 將P19細(xì)胞移植入大鼠心肌梗死心肌內(nèi)，觀察其分化情況。P19細(xì)胞復(fù)蘇、傳代后，通過(guò)局部注射將其移植入大鼠梗死心肌，分別于移植后4周、8周，通過(guò)心肌標(biāo)志物—心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、連接蛋白43(Connecxin43)、α-肌節(jié)型肌動(dòng)蛋白(α-sarcomericactin)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示：(1)細(xì)胞移植區(qū)有GATA-4表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，棕色陽(yáng)性顆粒表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，在移

11、植4周，移植部位有較少的GATA-4陽(yáng)性細(xì)胞，在移植后8周，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多。(2)移植后4周，移植細(xì)胞未見(jiàn)α-sarcomericactin陽(yáng)性表達(dá)。移植后8周，在位于移植區(qū)與正常心肌交界處的部分移植細(xì)胞胞質(zhì)中α-sarcomericactin表達(dá)陽(yáng)性。(3)移植后4周，移植細(xì)胞未見(jiàn)connexin43陽(yáng)性表達(dá)，移植后8周，在位于移植區(qū)與正常心肌交界處的部分移植細(xì)胞胞質(zhì)中，connexin43表達(dá)陽(yáng)性。此結(jié)果表明P19細(xì)胞在體內(nèi)心肌環(huán)

12、境中可向心肌樣細(xì)胞分化。3P19細(xì)胞移植改善心肌梗死大鼠心功能 觀察P19細(xì)胞移植入大鼠梗死心肌后其存活情況及對(duì)大鼠心功能的影響。方法：正常雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分成移植組(n=20)和對(duì)照組(n=10)，用液氮冷凍方法，建立大鼠心肌梗死模型，大鼠心肌梗死后立即將復(fù)蘇后培養(yǎng)4～5代的P19細(xì)胞以4×106個(gè)/ml通過(guò)局部注射方法移植入心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)，對(duì)照組注射等量的培養(yǎng)液。8周后觀察植入細(xì)胞的存活情況，并通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)

13、指標(biāo)評(píng)價(jià)P19細(xì)胞移植對(duì)大鼠心功能的改善情況。結(jié)果：大鼠心肌梗死模型成功率80％。HE染色顯示移植細(xì)胞存活者6例，作為統(tǒng)計(jì)范圍。移植組左心室收縮壓(LVSP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp/dtmax)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，左心室舒張末期壓(LVEDP)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。移植組有1例檢測(cè)心功能時(shí)發(fā)現(xiàn)有偶發(fā)室性早搏。結(jié)論：P19細(xì)胞移植入大鼠心肌梗死區(qū)后能夠存活，并明顯改善心肌梗死后大鼠的心功能；P19細(xì)胞

14、可以作為研究心肌梗死細(xì)胞移植療法的模型細(xì)胞。 結(jié)論1含10％胎牛血清和15％胎牛血清培養(yǎng)液中P19細(xì)胞的細(xì)胞聚集體形成率比含5％胎牛血清的培養(yǎng)液高，差異顯著；含10％胎牛血清與含15％胎牛血清的培養(yǎng)液中，P19細(xì)胞聚集體形成率比較無(wú)顯著差異。 2P19細(xì)胞在DMSO誘導(dǎo)下，心肌標(biāo)志物GATA-4，α-sarcomericactin，Connecxin43表達(dá)陽(yáng)性，超微結(jié)構(gòu)變化顯示細(xì)胞出現(xiàn)緊密連接和中間連接，并有肌絲形成，

15、表明細(xì)胞向心肌方向分化，有類似胚胎心肌細(xì)胞形成。 3P19細(xì)胞移植到大鼠梗死心肌后，隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)，能夠增殖分化，表達(dá)心肌標(biāo)志物GATA-4、α-sarcomericactin及Connexin43，表明P19細(xì)胞在大鼠體內(nèi)心肌環(huán)境中可以向心肌樣細(xì)胞分化。 4用液氮冷凍方法可以造成大鼠心肌梗死模型，模型成功率為80％。5大鼠梗死心肌經(jīng)P19細(xì)胞移植治療，心功能血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示，與z 對(duì)照組相比，移植組LVS