DJ-1通過激活Nrf2信號(hào)通路上調(diào)抗氧化酶介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù).pdf

1、目的：從Nrf2信號(hào)通路及其所調(diào)控的抗氧化酶（MnSOD、HO-1）表達(dá)改變的角度探討DJ-1介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)（HPC）延遲保護(hù)的分子機(jī)制。
　　方法：⑴利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞，分別經(jīng)pFlag-hDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFlag瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后，建立HPC模型；HPC24h后，通過檢測以下變化，以求觀察DJ-1不同表達(dá)水平對(duì)HPC預(yù)處理H9c2細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號(hào)通路

2、的影響：Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)DJ-1蛋白表達(dá)的變化；免疫共沉淀（Co-IP）檢測Nrf2-Keap1的解離情況；Western Blot檢測Nrf2核轉(zhuǎn)位變化；染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）法檢測胞核內(nèi)Nrf2與HO-1及MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合的變化。⑵利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1siRNA細(xì)胞，分別經(jīng)pFlag-hDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFlag瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h

3、后，建立HPC模型；HPC24 h后，通過Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（MnSOD、HO-1）蛋白表達(dá)的變化，以求觀察DJ-1不同表達(dá)水平對(duì)HPC預(yù)處理H9c2細(xì)胞內(nèi)MnSOD、HO-1蛋白表達(dá)的影響。⑶利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞，分別經(jīng)pFlag-hDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFlag瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞分別用Nrf2 siRNA或陰性對(duì)照siRNA（NC siRNA

4、）轉(zhuǎn)染24 h，隨后建立HPC模型；HPC24h后，通過Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)Nrf2及抗氧化酶（MnSOD、HO-1）蛋白表達(dá)的變化，以求觀察Nrf2信號(hào)通路的抑制對(duì)DJ-1所依賴的HPC上調(diào)H9c2細(xì)胞內(nèi)MnSOD、HO-1蛋白表達(dá)的影響。⑷利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞，分別經(jīng)pFlag-hDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFlag瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞分別用Nrf2 siRN

5、A或陰性NC siRNA轉(zhuǎn)染24 h，隨后建立HPC延遲保護(hù)模型和缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷模型，通過檢測以下變化，以求觀察Nrf2信號(hào)通路的抑制對(duì)DJ-1所介導(dǎo)的HPC延遲保護(hù)的影響：MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞存活率的變化；根據(jù)試劑盒說明分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)LDH活性變化；應(yīng)用比色法測定MDA含量；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量的變化。
　　結(jié)果：①在H9c2細(xì)胞，HPC24h后能顯著上調(diào)DJ-1蛋白表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Nrf

6、2與其抑制蛋白 Keap1解離，并促進(jìn) Nrf2入核，增加 Nrf2在胞核內(nèi)與 HO-1及MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)ARE的結(jié)合。然而，在DJ-1低表達(dá)的H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞，HPC上述效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。此外，H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞經(jīng)pFlag-hDJ-1轉(zhuǎn)染進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)后，DJ-1蛋白表達(dá)恢復(fù)，同時(shí)伴隨HPC上述效應(yīng)的恢復(fù)。②在H9c2細(xì)胞，HPC24h后能顯著上調(diào)HO-1及MnSOD蛋白表達(dá)。然而，在DJ-1低表達(dá)

7、的H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞，DJ-1沉默對(duì)HPC所誘導(dǎo)的HO-1及MnSOD蛋白表達(dá)上調(diào)呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。同樣，H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞經(jīng)pFlag-hDJ-1轉(zhuǎn)染后，HPC上調(diào)HO-1及MnSOD蛋白表達(dá)的效應(yīng)也被恢復(fù)。③H9c2細(xì)胞經(jīng)Nrf2 siRNA處理后產(chǎn)生DJ-1沉默相似效應(yīng)，對(duì)HPC所誘導(dǎo)的HO-1及MnSOD蛋白表達(dá)上調(diào)呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。更為重要的是，H9c2/DJ-1siRNA細(xì)胞經(jīng)pFlag-hDJ-1轉(zhuǎn)

8、染后，HPC上調(diào)HO-1及MnSOD蛋白表達(dá)的回復(fù)效應(yīng)也被Nrf2 siRNA所逆轉(zhuǎn)。④在H9c2細(xì)胞，HPC24 h后可顯著提高H/R損傷心肌細(xì)胞的生存率，抑制 LDH的活性；并能顯著減少 H9c2心肌細(xì)胞 H/R過程中所產(chǎn)生的活性氧（ROS），同時(shí)減少M(fèi)DA的生成。然而，在DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細(xì)胞，HPC上述效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。更為有趣的是，H9c2細(xì)胞經(jīng)Nrf2 siRNA處理后同樣產(chǎn)生DJ-1沉默相似效應(yīng)，對(duì)HP