外源性NAD+通過Sirt1-p53通路保護缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞.pdf

1、目的：
　　尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine d inucleotide，NAD+)不僅是線粒體有氧呼吸中的電子傳遞體，而且是第三類組蛋白/非組蛋白去乙?；窼irt1必需的反應(yīng)底物。然而，缺血再灌注損傷能消耗心肌細胞中的NAD+。本研究探討外源性加入NAD+對缺氧復(fù)氧條件下-H9c2心肌細胞生存率和細胞凋亡率的影響，以及該作用與Sirt1的關(guān)系，以分析NAD+在缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞中的

2、可能作用機制。
　　方法：
　　第一部分:探討不同作用時間點和不同處理濃度的外源性NAD+對缺氧復(fù)氧條件下H9c2細胞生存率的影響。
　　用含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細胞48小時后，在無糖無血清的“缺血緩沖液”中1％氧濃度下培養(yǎng)4小時隨即在完全培養(yǎng)液中正常氧濃度下培養(yǎng)4小時以建立缺氧復(fù)氧模型。NAD+(500μmol/L)在缺氧前2小時、缺氧開始時、缺氧開始后2小時、復(fù)氧開始時和復(fù)氧開始

3、后2小時分別加入不同培養(yǎng)孔中，采用Cck-8法檢測心肌細胞生存率。不同作用濃度（0、50、100、500、1000和5000μmol/L）的NAD+在復(fù)氧開始時處理H9c2心肌細胞，采用Cck-8法檢測心肌細胞生存率。
　　第二部分:探討外源性NAD+對缺氧復(fù)氧條件下H9c2心肌細胞凋亡率的影響，以及其與Sirt1-p53通路的關(guān)系。
　　采用含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細胞48小時后，將細胞隨

4、機分為6組:對照組(CON組)、缺氧復(fù)氧組(HR組)、單純NAD+處理組(NAD組)、NAD+處理+缺氧復(fù)氧組(NADHR組)、Sirt1抑制劑+NAD+處理+缺氧復(fù)氧組(ENHR組)和Sirt1抑制劑+缺氧復(fù)氧組（EHR組）。CON組:心肌細胞在完全條件下培養(yǎng)8小時。HR組:心肌細胞在“缺血緩沖液”中1％氧濃度下培養(yǎng)4小時（缺氧）隨即在完全培養(yǎng)液中正常氧濃度下培養(yǎng)4小時（復(fù)氧）。NAD組:心肌細胞在完全條件下培養(yǎng)8小時，并且NAD+在

5、細胞培養(yǎng)4小時后加入培養(yǎng)液中。NAD+HR組:心肌細胞缺氧4小時復(fù)氧4小時，并且NAD+（500μmol/L）在復(fù)氧開始時加入細胞培養(yǎng)液中。ENHR組:心肌細胞缺氧4小時復(fù)氧4小時，并且NAD+（500μmol/L）和Sirt1活性抑制劑EX527(1μmol/L)在復(fù)氧開始時加入細胞培養(yǎng)液中。EHR組:心肌細胞缺氧4小時復(fù)氧4小時，并且Sirt1活性抑制劑EX527（1μmol/L）在復(fù)氧開始時加入細胞培養(yǎng)液中。實驗完成后，采用TUN

6、EL法檢測心肌細胞凋亡率，Western Blot法檢測心肌細胞內(nèi)Sirt1和BAX表達量以及細胞核內(nèi)p53和ac-p53(lys373&382)的表達量，細胞核內(nèi)Sirt1活性檢測試劑盒檢測Sirt1的活性。
　　結(jié)果：
　　第一部分:
　　外源性NAD+在不同作用時間點和不同作用濃度時對缺氧復(fù)氧條件下H9c2心肌細胞生存率的影響不同。當NAD+（500μmol/L）在缺氧開始前2小時加入細胞培養(yǎng)液中時，缺氧復(fù)氧條件

7、下的H9c2心肌細胞生存率有一定程度但不顯著的升高;當NAD+在其余時間點加入細胞培養(yǎng)液時，缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞生存率顯著升高。當NAD+(500μmol/L)在復(fù)氧開始時立即加入細胞培養(yǎng)液中導(dǎo)致的缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞生存率升高程度最大。當NAD+的作用濃度為50μmol/L時缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞生存率有一定程度但不顯著的升高;其它的NAD+作用濃度均使得缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞生存率顯著升高

8、。當NAD+的作用濃度為500-1000μmol/L時缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞生存率升高程度最大。
　　第二部分:
　　各組細胞凋亡率和促凋亡蛋白BAX表達量比較:
　　與CON組比較，HR組心肌細胞凋亡率顯著升高，促凋亡蛋白BAX表達量顯著升高;與HR組比較，NADHR組心肌細胞凋亡率顯著降低，BAX蛋白表達量顯著降低。與NADHR組比較，ENHR組細胞凋亡率再次顯著升高，BAX蛋白表達量再次顯著升高。

9、>　　各組Sirt1含量和活性比較:
　　與CON組比較，HR組H9c2心肌細胞核內(nèi)Sirt1活性顯著降低;與HR組比較，NADHR組H9c2心肌細胞核內(nèi)Sirt1活性顯著升高。與 NADHR組比較，ENHR組H9c2心肌細胞核內(nèi)Sirt1活性顯著降低。各組心肌細胞內(nèi)Sirt1表達量無顯著差異。
　　各組ac-p53(lys373&382)/p53表達比例比較:與CON組比較，HR組H9c2心肌細胞核內(nèi)ac-p53(lys3

10、73&382)/p53表達比例顯著升高;與HR組比較，NADHR組H9c2心肌細胞核內(nèi)ac-p53(lys373&382)/p53表達比例顯著降低。與NADHR組比較，ENHR組ac-p53(lys373&382)/p53表達比例顯著升高。
　　結(jié)論：
　　外源性加入NAD+能降低缺氧復(fù)氧條件下的H9c2心肌細胞死亡，并且該作用具有時間依賴性和藥物濃度依賴性。當NAD+在復(fù)氧開始時加入細胞培養(yǎng)液，以及NAD+的作用濃度為50