原花青素通過激活STAT3通路抑制內質網應激發(fā)揮對H9C2心肌細胞缺氧-復氧損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:盡早實行再灌注治療是缺血性心臟病治療的關鍵，然而，再灌注后可以引起缺血/再灌注損傷(IRI)。近年來研究表明內質網應激(ERS)在IRI的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。藥物預適應是緩解心肌IRI的有效措施，原花青素(PC)是一種強效的天然抗氧化劑，具有眾多生物活性，如抗凋亡、抗腫瘤、保護心血管等作用?？紤]到ERS在心肌IRI中扮演的重要角色，以及PC對心肌IRI的保護作用，我們設想內質網可能為PC減輕心肌IRI損傷的作用靶點。本研究

2、以大鼠H9C2心肌細胞缺氧/復氧(H/R)模型為研究對象，第一部分研究觀察PC對H/R損傷后心肌細胞存活率、乳酸脫氫酶(LDH)活性、細胞凋亡程度以及ERS標志蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）表達的影響，并探討PC劑量效應關系;第二部分研究觀察PC對H/R后細胞凋亡程度、信號轉導子和激活子3(STAT3)通路、ERS及其相關凋亡通路蛋白和基因表達的影響，并觀察應用STAT3特異性抑制劑Stattic處理后以上各參數的變化，探討STA

3、T3通路在PC保護H/R后心肌細胞損傷中發(fā)揮的作用，以及STAT3通路與ERS的關系及調控機制。
　　方法:
　　第一部分:1.建立缺氧/復氧模型，探索最佳復氧時間:H9C2心肌細胞（購自中科院上海細胞庫）分為6組，分別為空白對照組、缺氧3h復氧1h組、缺氧3h復氧3h組、缺氧3h復氧6h組、缺氧3h復氧12h組、缺氧3h復氧24h組。缺氧培養(yǎng)時將培養(yǎng)基更換為無糖無血清、缺氧的DMEM培養(yǎng)基置于37℃充滿95％N2和5％ C

4、O2的三氣培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3h，然后更換為正常培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱分別行不同時間復氧，光鏡下觀察細胞形態(tài)，MTT檢測細胞存活率，檢測細胞LDH活性，確定最佳復氧時間nh。
　　2.觀察PC對H/R后心肌細胞保護作用:H9C2心肌細胞分為6組:1）空白對照組;2）缺氧/復氧組（H/R組）:將細胞置于37℃、充滿95％N2、5％CO2的三氣培養(yǎng)箱內缺氧3h，然后更換DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、充滿95％空氣、5％CO2的培

5、養(yǎng)箱內按探索的最佳復氧時間復氧nh;3）缺氧/復氧+低劑量原花青素組（H/R+LPC組）:50μg/ml PC孵育細胞30min后行缺氧/復氧過程;4）缺氧/復氧+中劑量原花青素組（H/R+MPC組）:100μg/ml PC孵育細胞30min后行缺氧/復氧過程;5）缺氧/復氧+高劑量原花青素組（H/R+HPC組）:200μg/ml PC孵育細胞30min后行缺氧/復氧過程;6）缺氧/復氧+4-苯基丁酸鈉組（H/R+4-PBA組）:1mM

6、4-PBA孵育細胞30min后行缺氧/復氧過程。各組細胞處理后光鏡下、透射電鏡下觀察細胞形態(tài)，MTT檢測細胞存活率，檢測細胞LDH活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Westem blotting檢測細胞GRP78蛋白表達水平。
　　第二部分:H9C2心肌細胞分為7組:1）空白對照組;2）原花青素組(PC組):H9C2心肌細胞正常培養(yǎng)，采用100μg/ml PC處理細胞30min;3）Stattic組（S組）:采用1μM Statti

7、c處理細胞1h;4）缺氧/復氧組（H/R組）:將細胞置于37℃、充滿95％N2、5％CO2的三氣培養(yǎng)箱內缺氧3h，然后更換DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、充滿95％空氣、5％CO2的培養(yǎng)箱內復氧nh;5）缺氧/復氧+原花青素組（H/R+PC組）:先給予細胞100μg/ml PC預處理30 min，再按H/R組過程行缺氧/復氧過程;6）缺氧/復氧+Stattic組（H/R+S組）:細胞缺氧/復氧前加入1μM Stattic預處理1h，再按H/

8、R組過程行缺氧/復氧過程;7）缺氧/復氧+原花青素+Stattic組（H/R+PC+S組）:細胞經1μM Stattic預處理1h后，加入100μg/ml PC孵育30 min，再按H/R組過程行缺氧/復氧過程。各組細胞處理后MTT檢測細胞存活率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blotting檢測細胞STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、GRP78、PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、CHOP、IRE1、磷酸

9、化IRE1(p-IRE1)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、ATF6、Caspase-12蛋白的表達，Real-Time PCR檢測細胞GRP78、PERK、CHOP、JNK、ATF6、Caspase-12 mRNA的表達。
　　結果:
　　第一部分:1、1）光鏡下顯示，對照組心肌細胞貼壁生長良好，細胞呈梭形或多角形，簇狀生長，細胞折光性強。隨著復氧的開始，細胞變圓、拉長，細胞折光性下降，存活細胞數目減少，圓形漂浮細胞增

10、多，其中復氧3h、6h比復氧1h存活細胞明顯減少，復氧3h、6h比較細胞形態(tài)差別不大，復氧12h、24h較3h、6h圓形漂浮細胞更多。2）與對照組相比，H/R組細胞存活率下降，復氧后3h、6h、12h、24h細胞存活率與對照組有顯著差異(P＜0.01);復氧后3h、6h、12h、24h各組之間細胞存活率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。3)與對照組相比，H/R組細胞LDH活性均明顯上升(P＜0.01);復氧后3h、6h、12h各組細胞之間的

11、LDH活性無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);故選擇復氧3h為后續(xù)實驗H/R模型復氧時間。
　　2、1)光鏡下顯示，與對照組相比，H/R組細胞形態(tài)發(fā)生明顯損傷變化，不同濃度PC預處理和4-PBA預處理可改善細胞形態(tài)的變化。2）透射電鏡下顯示，與對照組相比，H/R組心肌細胞出現明顯損傷，表現為核膜缺損，線粒體腫脹、空泡化，內質網擴張，并出現大量凋亡小體;不同濃度PC預處理和4-PBA預處理可改善細胞超微結構形態(tài)的變化。3）與對照組相比，H

12、/R組細胞存活率顯著降低(P＜0.01);與H/R組相比，H/R+M/HPC組心肌細胞存活率顯著提高（P＜0.01），H/R+LPC組細胞存活率升高不明顯(P＞0.05)，其中H/R+MPC組細胞存活率提高最多;中、高劑量PC預處理組與4-PBA預處理組心肌細胞存活率無明顯差異(P＞0.05)。4）與對照組相比，H/R組心肌細胞LDH活性明顯升高(P＜0.01);與H/R組相比，不同濃度PC預處理組的LDH活性均明顯降低(P＜0.05)

13、;不同濃度PC預處理組和4-PBA預處理組間LDH活性無明顯差異（P＞0.05）。5）與對照組相比，H/R組心肌細胞凋亡和壞死數量顯著上升（P＜0.01）;與H/R組相比，不同濃度PC預處理組心肌細胞凋亡及壞死出現不同程度的明顯減少(P＜0.05)，中劑量PC組細胞凋亡減少最明顯;中劑量PC預處理組心肌細胞凋亡率與4-PBA預處理組未見明顯差異，而低、高劑量PC預處理組細胞凋亡率高于4-PBA預處理組(P＜0.05)。6)H/R組蛋白G

14、RP78表達較對照組明顯增加(P＜0.01)，不同濃度PC預處理組GRP78蛋白表達皆下降(P＜0.05);GRP78蛋白表達在H/R+MPC組與H/R+4-PBA組間無明顯差異(P＞0.05)，而H/R+LPC、H/R+HPC組GRP78蛋白表達量稍高于H/R+4-PBA組（P＜0.05）。
　　第二部分:1、與對照組相比，PC組和S組細胞存活率、凋亡率、蛋白和mRNA表達皆無明顯變化(P＞0.05，除外S組p-STAT3/ST

15、AT3表達低于對照組和PC組)，說明本實驗中PC和Stattic藥物濃度對心肌細胞無損傷。
　　2、與對照組相比，H/R組細胞存活率顯著下降，凋亡率顯著升高(P＜0.01)。與H/R組相比，PC預處理可顯著提高細胞存活率、減少細胞凋亡(P＜0.01);應用了STAT3通路阻斷劑后，PC的改善作用明顯減弱（P＜0.01）。
　　3、與對照組相比，H/R組細胞p-STAT3/STAT3比值顯著上升(P＜0.01)。與H/R組相比

16、，PC預處理使STAT3磷酸化進一步增加(P＜0.01);給予STAT3特異性抑制劑Stattic后，PC激活STAT3磷酸化的作用被抑制(P＜0.01)。
　　4、與對照組相比，H/R組ERS及其凋亡通路相關蛋白和mRNA表達皆顯著上升(P＜0.01)。與H/R組相比，PC預處理抑制了ERS及其凋亡通路相關蛋白和mRNA的表達（P＜0.01）;給予STAT3特異性抑制劑Stattic后，PC對H/R誘導的蛋白和mRNA高表達的保

17、護作用被抑制(P＜0.01)。PERK、JNK的mRNA表達各組間無明顯差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　1、缺氧3h復氧3h為本實驗中H9C2心肌細胞最佳H/R模型制備時間。
　　2、PC預處理可通過抑制ERS減少H/R引起的細胞損傷和凋亡，PC作用效果不隨濃度增加而增大，本研究100μg/ml PC對H3h/R3h心肌細胞提供最佳保護作用。
　　3、心肌細胞H/R過程中，PC可激活STAT3信號轉導通路