鈣拮抗劑通過(guò)調(diào)控MIF的表達(dá)拮抗大鼠心肌缺血-再灌注損傷和H9c2心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的研究.pdf

1、心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）損傷，是指心肌組織缺血后血流重新恢復(fù)，組織的損傷程度較缺血時(shí)進(jìn)一步加重、器官功能進(jìn)一步惡化的現(xiàn)象。鈣拮抗劑通過(guò)阻斷鈣離子通道，抑制細(xì)胞外 Ca2+內(nèi)流，拮抗鈣超載從而保護(hù)心肌損傷。研究表明，鈣拮抗劑除了阻斷L-型電壓依賴性鈣離子通道（L-type voltage dependent calcium channel， L-VDCC）發(fā)揮抗心肌I/R損傷的效應(yīng)之外，其心肌保

2、護(hù)效應(yīng)還可能存在非L-VDCC依賴機(jī)制。本課題組前期研究表明，臨床常用鈣拮抗劑維拉帕米(verapamil，Ver)、硝苯地平(nifedipine，Nif)與碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide，F(xiàn)2，我實(shí)驗(yàn)室合成的新型結(jié)構(gòu)鈣拮抗劑，圖1)在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型上，可通過(guò)非L-VDCC途徑拮抗心肌細(xì)胞H/R損傷。
　　目的：

3、>　　探討鈣拮抗劑不影響鈣通道阻斷所致血液動(dòng)力學(xué)變化的劑量，對(duì)心肌 I/R損傷和 MIF表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在無(wú)鈣液培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞上觀察鈣拮抗劑對(duì)H/R損傷的影響，確認(rèn)鈣拮抗劑的非L-VDCC依賴機(jī)制。
　　方法：
　?、艑⑿坌許D大鼠隨機(jī)分組如下進(jìn)行 MIF時(shí)效關(guān)系實(shí)驗(yàn)：假手術(shù)組（Sham）；缺血5 min組（I5min）；缺血15 min組（I15min）；缺血30 min組（I30min）；缺血45

4、min組（I45min）；缺血60 min組（I60min）；缺血45 min再灌注0.5h組（I45min/R0.5h）；缺血45 min再灌注1h組（I45min/R1h）；缺血45 min再灌注2h組（I45min/R2h）；缺血45 min再灌注3h組（I45min/R3h）；缺血45 min再灌注4h組（I45min/R4h）；缺血45 min再灌注6h組（I45min/R6h）。⑵將雄性SD大鼠隨機(jī)分組如下進(jìn)行藥效關(guān)系實(shí)驗(yàn)：

5、假手術(shù)組（Sham）；模型組（I45min/R3h）；溶劑組（DMSO）；模型+鈣拮抗劑組（F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）、Nif（0.2 mg/kg）和Dil（0.5 mg/kg））。⑶Western-blot檢測(cè)心肌組織Cleaved caspase-3的表達(dá)。⑷TUNEL檢測(cè)心肌組織細(xì)胞晚期凋亡。⑸ELISA檢測(cè)心肌組織炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。⑹Western-blot和免疫組織

6、化學(xué)法檢測(cè)心肌組織MIF蛋白的表達(dá)。⑺ELISA檢測(cè)血清MIF的含量。⑻將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組如下進(jìn)行Cleaved caspase-3時(shí)效實(shí)驗(yàn)：正常組（Ctrl）；缺氧0.5h組（H0.5h）；缺氧1h組（H1h）；缺氧2h組（H2h）；缺氧3h組（H3h）；缺氧1h復(fù)氧0.5h組（H1h/R0.5h）；缺氧1h復(fù)氧1h組（H1h/R1h）；缺氧1h復(fù)氧2h組（H1h/R2h）；缺氧1h復(fù)氧3h組（H1h/R3h）；缺氧1h復(fù)氧4

7、h組（H1h/R4h）。⑼將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組如下進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)：正常組（Ctrl）；無(wú)鈣組（0Ca2+2h）；無(wú)鈣+鈣拮抗劑組（0Ca2+2h+鈣拮抗劑）；模型組（H1h/R1h）；溶劑組（DMSO）；模型+鈣拮抗劑組（鈣拮抗劑）。⑽Western-blot檢測(cè)Cleaved casepase-3的表達(dá)。⑾Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞早晚期凋亡。⑿TUNEL檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡。⒀ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液炎癥因子IL-6

8、和IL-1β的含量。
　　結(jié)果：
　?、倥cSham組相比，大鼠心肌缺血45 min再灌注3 h（I45min/R3h）引起心肌Cleaved caspase-3表達(dá)增加、凋亡細(xì)胞增加、炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量增加。②與I45min/R3h組相比，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R心肌 Cleaved caspase-3表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡。③與I45min/R3h組相比，F(xiàn)2（1.5 mg/kg

9、）能減少大鼠心肌I/R炎癥因子TNF-α表達(dá)， F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R IL-6的表達(dá)，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R IL-1β的表達(dá)。④與Sham組相比，大鼠心肌I45min/R3h引起心肌組織MIF蛋白和mRNA表達(dá)減少，血清MIF含量增加。與I45min/R3h組相比，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）、

10、Ver（0.75 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能上調(diào)大鼠心肌I/R MIF蛋白表達(dá)，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R血清MIF的含量。⑤與Ctrl組相比，H9c2心肌細(xì)胞在無(wú)鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h引起Cleaved caspase-3的表達(dá)增加，但是鈣拮抗劑不能減少Cleaved caspase-3的表達(dá)。與Ctrl組相比，無(wú)鈣液培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞缺氧1h/復(fù)氧1h（H1h/R1

11、h）Cleaved caspase-3增加，Annexin V-FITC/PI檢測(cè)的早晚期凋亡細(xì)胞率增加，TUNEL檢測(cè)的晚期凋亡細(xì)胞率增加，ELISA檢測(cè)的細(xì)胞上清液中IL-6和IL-1β的含量增加。⑥與H1h/R1h組相比，Ver、Nif和F2能顯著減少無(wú)鈣液培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞H/R Cleaved caspase-3的表達(dá)，Ver、Nif和F2能劑量依賴地減少無(wú)鈣液培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞H/R早晚期凋亡細(xì)胞率。⑦與H1h/R1h