DJ-1穩(wěn)定高表達(dá)對(duì)模擬缺血-再灌注所致H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建DJ-1真核表達(dá)載體，篩選DJ-1穩(wěn)定高表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞系;在此基礎(chǔ)上，探討DJ-1高表達(dá)能否對(duì)抗模擬缺血再灌注(sI/R)所誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，并進(jìn)一步探求其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.根據(jù)大鼠DJ-1基因序列(NM_057143.1，CDS298～867)，設(shè)計(jì)特異性克隆引物，提取大鼠心肌樣細(xì)胞系H9c2細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法獲取DJ-1全長(zhǎng)cDNA，克隆至真核表達(dá)載體pFL

2、AG-CMV-4，構(gòu)建DJ-1真核表達(dá)重組質(zhì)粒(pFLAG-CMV-4-DJ-1)，應(yīng)用菌落PCR及DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定，確認(rèn)后轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)篩選出兩株DJ-1穩(wěn)定高表達(dá)的H9c2細(xì)胞系（H9c2/DJ-1-A和H9c2/DJ-1-B），并通過(guò)Western blot測(cè)定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中DJ-1蛋白的表達(dá)而加以鑒定，同時(shí)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-4空載質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞系（H9c2/Sham）作為對(duì)照用于后續(xù)細(xì)

3、胞實(shí)驗(yàn);
　　2.各取未轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞、陰性對(duì)照的H9c2/Sham細(xì)胞、DJ-1高表達(dá)的H9c2/DJ-1-A及H9c2/DJ-1-B細(xì)胞分為對(duì)照組（Control）和模擬缺血再灌注組(sI/R)。實(shí)驗(yàn)處理后，利用MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率;按試劑盒說(shuō)明測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)LDH漏出量、MDA含量及抗氧化物酶CAT、SOD和GPx的活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的變化;RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)各

4、組細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶CAT、MnSOD和GPx的mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)基因測(cè)序鑒定證實(shí)，DJ-1真核表達(dá)重組質(zhì)粒pFLAG-CMV-4-DJ-1構(gòu)建成功;2.Western blot檢測(cè)表明穩(wěn)定篩選的H9c2/DJ-1-A和H9c2/DJ-1-B細(xì)胞系中DJ-1蛋白表達(dá)與未轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞比較分別提高了2.6和2.5倍;3.未轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞及H9c2/Sham細(xì)胞經(jīng)sI/R處理后，細(xì)胞存活率

5、均明顯下降、LDH漏出量顯著增加、細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增加，CAT、SOD及GPx的酶活性下降，與相應(yīng)的Control組比較均具有顯著性差異(P＜0.01)。然而，DJ-1高表達(dá)的H9c2/DJ-1-A和H9c2/DJ-1-B細(xì)胞經(jīng)sI/R處理后，細(xì)胞生存率較未轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞的sI/R組明顯上升、LDH漏出量顯著降低;同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA含量減少、抗氧化酶SOD、GPx及CAT酶活性上升，與未轉(zhuǎn)染H9c

6、2細(xì)胞的sI/R組比較均具有顯著性差異(p＜0.01)，表明DJ-1高表達(dá)的H9c2細(xì)胞對(duì)sI/R所致的氧化應(yīng)激損傷具有一定的抵抗力。此外，RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示DJ-1高表達(dá)的H9c2/DJ-1-A和H9c2/DJ-1-B細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶MnSOD、GPx、CAT的mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，與未轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞比較均存在顯著性差異(p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了pFLAG-CM