臭氧化鹽水通過激活Keapl-Nrf2-ARE通路保護肝組織細胞的研究.pdf

1、化學物質(zhì)肝臟代謝主要分為兩相,Ⅰ相代謝(phase1)主要是體內(nèi)小分子物質(zhì)(如谷胱甘肽、葡糖醛酸、維生素E等)直接與氧化物或毒性物質(zhì)反應,使其失活減少毒性,此反應為快速反應。Ⅱ相代謝(phase2)是酶促反應,在Ⅱ相代謝酶如過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GST)、環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase)、磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotranserase)、乙?；D(zhuǎn)移酶

2、(acetyltransferase)、醌氧化還原酶Ⅰ(quinoneoxidoreductasel,NQO1)等的催化下,將內(nèi)源性極性小分子物質(zhì)經(jīng)共價鍵結合到外來物質(zhì)或Ⅰ相代謝活化物的分子上,使之親水性增強,促進其排出體外。它們能消除有害物質(zhì)對機體DNA及生物功能蛋白的破壞,以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,因此誘導Ⅱ相代謝酶基因的表達可以增強機體抗氧化、抗突變和抗腫瘤的能力。Ⅱ相代謝酶的啟動子區(qū)域有特定的DNA序列即抗氧化反應元件(antio

3、xidant responsive element,ARE),可通過化學預防劑、氧化應激或者親電子物質(zhì)誘導激活。
　　 細胞轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(nuclear factor erythroid2-relatexl factor2)屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)蛋白質(zhì)家族,是包括p45、Nrf1、Nrf2、Nrf3在內(nèi)的CNC(cap'n'collar)轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,主要在代謝性和解毒組織器官中表達,如肝

4、臟、腎臟及其它持續(xù)暴露于環(huán)境中的組織如皮膚、肺、消化管等。Nrf2是細胞調(diào)節(jié)抗氧化應激反應的重要轉(zhuǎn)錄因子,通過與抗氧化反應元件相互作用,可上調(diào)多種抗氧化酶及解毒酶,提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物質(zhì)的表達水平,維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài),發(fā)揮細胞保護作用。Nrf2生理狀態(tài)下位于細胞質(zhì)中,與胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Kelch-1ike ECH-associated protein1)結合,處于無活性狀態(tài),并瞬即降解。Keap1

5、是一個與胞漿肌動蛋白結合的含624個氨基酸的多肽,包含NTR、BTB/POZ、IVR、DGR、CTR5個區(qū)。DGR區(qū)(dlouble glycine repeat,DGR)含有6個雙甘氨酸重復序列,是Keap1與Nrf2的Neh2區(qū)結合位點,也是Keap1與胞漿內(nèi)肌動蛋白結合區(qū)位。BTB/POZ區(qū)的作用是介導Keap1二聚體化并與Nrf2-Keap1結合力有關,BTB/POZ區(qū)Ser-104突變影響Kealp1二聚體化,可干擾Kemp1

6、錨定Nrf2的功能。Keap1與親電子化合物及氧化劑的反應發(fā)生在插入?yún)^(qū)IVR,這與IVR區(qū)富含半胱氨酸有關。同時IVR區(qū)參與泛素化連接酶形成,因此與Nrf2穩(wěn)定性有關。在活性氧或其他親核劑信號刺激下,Keap1或者Kealp1的DGR區(qū)構象發(fā)生變化,Nrf2進而從Keap1上解離出來,Nrf2與Keap1解偶聯(lián)后被激活轉(zhuǎn)移入細胞核中,和其他蛋白質(zhì)Maf、JunD、cJun、ATF4等結合形成穩(wěn)定異二聚體后,與位于Ⅱ相代謝酶基因的上游啟動

7、子區(qū)域的抗氧化反應元件上的GCTGAGTCA位點結合,調(diào)控下游Ⅱ相代謝酶基因的表達,增加細胞對氧化應激的抗性或耐受性。由此可見Keap1-Nrf2-ARE通路在Ⅱ相解毒酶基因的表達中發(fā)揮了關鍵的作用。目前研究證實,Keap1-Nrf2-ARE通路在抗腫瘤、抗應激、調(diào)節(jié)GSH合成、抗凋亡、抗炎癥反應、抗動脈粥樣硬化以及調(diào)節(jié)心腦血管反應、神經(jīng)保護等方面發(fā)揮著廣泛的細胞保護功能,Keap1-Nrt2-ARE系統(tǒng)是抵抗各種環(huán)境應激和內(nèi)源性應激防

8、御機制中必不可少的部分。Nrf2缺失或激活障礙可導致幾種常見的病理現(xiàn)象,包括化學物致腫瘤形成的易感性、藥源性急性肝毒性、對外來化合物以及紫外線的敏感性增高。目前Keap1-Nrf2-ARE通路的誘導物主要有邁克爾反應受體類(michael reaction acceptors)、聯(lián)苯芬類(dkiphenols)、苯醌類(quinones)、異硫氰酸鹽(isothiocyanates)、過氧化物類(peroxides)、硫醇類(merca

9、ptans)、三價砷類(trivalent arsenicals)、重金屬類(heavy metals)。
　　 臭氧(ozone,O3)是氧氣的同素異構體,由3個氧原子組成的分子,空氣中不穩(wěn)定、常溫常壓下半衰期約45 min轉(zhuǎn)化成氧氣。臭氧可溶于水,5分鐘達到飽和,溶解度隨著注入蒸餾水的臭氧濃度的增大而升高,相同條件下溶解度為氧氣的10倍,5℃條件下臭氧水半衰期為110小時。醫(yī)用臭氧是指由醫(yī)用純氧通過濃度可精密調(diào)控的臭氧發(fā)生器

10、產(chǎn)生的氧氣與臭氧的混合氣體,可用于臨床治療。醫(yī)用臭氧被認為是二十世紀新的氣體分子藥物。醫(yī)用臭氧由于具有改善循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫及抗炎鎮(zhèn)痛等功能,現(xiàn)已用于創(chuàng)傷或褥瘡愈合、椎間盤突出癥、外周血管疾病、病毒性肝炎、糖尿病、腫瘤輔助治療、類風濕性關節(jié)炎、關節(jié)炎及疼痛等治療。醫(yī)用臭氧作為一種強氧化劑,適當?shù)膭┝亢洼^小的濃度,可以誘導Ⅱ相抗氧化酶的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)醫(yī)用臭氧直腸灌注預處理后能夠減輕CCl4所致犬肝損傷,但其作用機制尚不清楚。醫(yī)用臭氧自體血回輸

11、療法是臭氧全身應用治療的主要方法,已應用30余年,盡管副作用少安全性高,但需要抽血100ml用于體外臭氧化,受外周血管狀況的影響,臨床應用不方便。探索臭氧化液體靜脈輸注方法替代臭氧自體血療法的努力一直未間斷。1994年Bocci等發(fā)現(xiàn)生理鹽水亦可臭氧化,能很好地保存臭氧及其衍生物,但認為高濃度臭氧化生理鹽水(臭氧濃度80μg/ml)靜滴對血管有刺激性,靜脈滴注可能引起化學性靜脈炎。俄羅斯學者臨床實踐發(fā)現(xiàn)低濃度臭氧化生理鹽水靜脈滴注與臭氧

12、自血治療一樣對一些患者有效,無明顯副作用。
　　 基于以上認識,本研究嘗試用醫(yī)用臭氧溶于生理鹽水制成飽和的臭氧鹽水(Ozonized Saline,OS),利用CCl4大鼠急性肝損傷動物模型,來探討靜脈應用臭氧鹽水對CCl4中毒大鼠肝臟的治療保護作用及其作用機理,為醫(yī)用臭氧的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 第一部分臭氧化鹽水對四氯化碳誘導的大鼠肝細胞氧化損傷的保護作用
　　 方法:
　　 采用40只成年健康

13、雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為8組,每組5只。第1組:正常對照組(NC組)；第2組:O2鹽水組(模型組)；第3～8組:OS組(實驗組),OS組(分為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml6個不同濃度組)予5ml/kg OS、模型組予5ml/kg氧氣鹽水每日尾靜脈注射,連續(xù)15天,第16天予50％CCl4橄欖油溶液2ml/kg腹腔注射造肝損傷模型。正常對照組無任何預處理,

14、正常喂養(yǎng)15天,第16天予橄欖油溶液2ml/kg腹腔注射1次。CCl4造?；蜷蠙煊腿芤鹤⑸?4小時后,檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肝組織總抗氧化能力(TAOC)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)水平。提取大鼠肝組織的核蛋白,運用免疫印跡方法測定其細胞核中Nrf2的含量,免疫熒光組織化學技術檢測細胞內(nèi)Nrt2的分布。
　　 結果:
　　 1)與NC組比

15、較,模型組ALT、AST均顯著升高(P<0.01),肝組織TAOC、GSH、GPx、CAT顯著降低(P<0.01),模型成功。
　　 2)與NC組比較,不同臭氧濃度OS組ALT、AST顯著升高(P<0.05),肝組織TAOC、GSH、GPx、CAT降低,部分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3)與模型組比較,5～50μg/ml6個不同臭氧濃度OS組ALT、AST均顯著降低(P<0.05),不同濃度OS組ALT、A

16、ST水平亦不同,以30μg/mlOS組最低,ALT、AST較模型組分別降低56.5％(P=0.007)、56.2％(P=0.000),差異有統(tǒng)計學意義,30μg/ml OS組ALT、AST與其他濃度的OS組比較部分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4)與模型組比較,5～50μg/ml6個不同臭氧濃度OS組TAOC、GSH、GPx、CAT升高,部分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中30μg/mlOS組TAOC、GSH、

17、GPx、CAT較模型組分別升高90.3％(P=0.000)、114.3％(P=0.000)、51.3％(P=0.001)、50.1％(P=0.013),差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 5)不同濃度OS組對大鼠抗氧化系統(tǒng)的影響亦不同,30μg/mlOS組TAOC、GSH、GPx、CAT與其他OS組比較,部分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 6)與NC組、模型組比較,OS組可明顯增加Nrf2在細胞核中的含量,不同濃度OS

18、所誘導的Nrf2含量也有差別,其中20-40μg/mlOS組含量較高。
　　 7)各臭氧濃度OS靜脈注射,大鼠未見化學性靜脈炎、體重不升和大鼠死亡等不良事件發(fā)生。
　　 第二部分30ug/ml臭氧化鹽水對大鼠正常肝組織細胞的抗氧化能力的影響
　　 方法:
　　 根據(jù)前面實驗的氧化損傷模型參數(shù),采用10只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為2組,每組5只。第1組:正常對照組(NC組)；第2組

19、:30μg/ml OS組(實驗組)。OS組予5ml/kg OS每日尾靜脈注射,連續(xù)15天,第16天予3％戊巴比妥鈉25mg/kg腹腔注射麻醉處死動物。正常對照組無任何預處理,正常喂養(yǎng)15天,第16天亦予3％戊巴比妥鈉25mg/kg腹腔注射麻醉處死。手術留取肝組織,檢測TAOC、GPx、CAT活性,利用免疫印跡法檢測肝細胞核內(nèi)Nrf2的含量,免疫熒光組織化學技術檢測細胞內(nèi)Nrf2的分布。
　　 結果:
　　 1)與NC組比

20、較,30ug/mlOS預處理可使大鼠肝組織TAOC、GPx、CAT活性升高,分別升高TAOC活性升高31.4％(P=0.005),GPx升高21.0％(P=0.023),CAT活性升高14.2％(P=0.040),差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 2)免疫印跡及免疫熒光均顯示OS能增強肝細胞核內(nèi)Nrf2的表達。
　　 全文結論:
　　 1)臭氧化鹽水靜脈注射預處理可使CCl4誘導的大鼠急性肝損傷減輕；
　　 2