普萘洛爾對(duì)映體在經(jīng)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞中的代謝特征.pdf

1、手性(Chirality) 是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，它引起分子的不對(duì)稱性。近年來(lái)，藥物手性的臨床意義已引起了人們的注意。人體的手性環(huán)境和特異的對(duì)映體相互作用，導(dǎo)致手性藥物對(duì)映體藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的立體選擇性(stereo-selectivity) 差異。在藥理手性差異中研究較多的是藥代動(dòng)力學(xué)的手性特征。它是基于藥物吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程的對(duì)映體選擇性。其中代謝性對(duì)映體選擇性發(fā)生率最高（約占40％），且臨床意義更大。以往由于沒(méi)有認(rèn)識(shí)到手性

2、藥物各對(duì)映體的藥動(dòng)學(xué)行為，特別是代謝的手性差異，所以在藥物相互作用研究中常常將消旋體藥物當(dāng)作單一化合物來(lái)處理。由此得出的結(jié)論常與臨床療效或不良反應(yīng)的發(fā)生存在著不一致的現(xiàn)象，甚至?xí)e(cuò)誤地指導(dǎo)臨床用藥。 藥物代謝主要在肝臟，依賴于細(xì)胞色素P450 ( cytochrome P450, CYP 450) ，它是藥物進(jìn)入體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的重要代謝酶, 參與各種內(nèi)源性和外源性化合物在體內(nèi)的代謝過(guò)程。該酶系具有專一性不強(qiáng)的特點(diǎn)，即同一種酶

3、可以代謝多種藥物，而同一藥物又可被多個(gè)肝藥酶所代謝。由于在肝細(xì)胞內(nèi)蘊(yùn)含有大量不同種類的肝藥酶，每一種藥物進(jìn)入體內(nèi)后，都可能由多種酶參與其代謝。因此宏觀的血藥濃度只能檢測(cè)出總體結(jié)果，不能考察每種酶對(duì)藥物的代謝情況。在聯(lián)合用藥過(guò)程中，特別是其中某一藥物使參與催化代謝的酶活性顯著增強(qiáng)或減弱時(shí)，就會(huì)引起其他合用藥物的毒副作用出現(xiàn)或未達(dá)療效的情況。對(duì)于對(duì)映體來(lái)說(shuō)，酶還表現(xiàn)出立體選擇性的差異，從而可能使其中占主藥效的一個(gè)對(duì)映體的代謝速度改變甚至逆轉(zhuǎn)

4、。因此，了解各種酶參與對(duì)映體的代謝的過(guò)程，可為臨床用藥提供參考依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究的手性藥物是普萘洛爾（Propranolol， PPL）對(duì)映體。普萘洛爾為非選擇性β-腎上腺素受體阻滯劑，口服后藥物達(dá)峰時(shí)間為1～3 小時(shí)，t1/2 為2～5 小時(shí)。 主要在肝臟代謝，首過(guò)效應(yīng)60％～70％，生物利用度僅為30％。臨床上使用的普萘洛爾是左旋異構(gòu)體S（-）- PPL 和右旋異構(gòu)體R（+）- PPL 等量混合的消旋品。目前已證實(shí)S(- )

5、型對(duì)映體的β受體阻斷作用要比R (+)型約強(qiáng)100 倍[6]。 普萘洛爾在CYP450酶系中代謝, 各亞族均有不同程度的催化作用，文獻(xiàn)顯示以CYP 2D6和CYP 1A2 作用較強(qiáng)。以往的研究主要是集中在兩個(gè)酶對(duì)普萘洛爾的代謝，而對(duì)其它酶參與其代謝的研究則甚少涉及。本課題選擇CYP 1A1和CYP 3A4進(jìn)行考察。 其主要的原因是CYP 1A1雖在肝臟中的含量很低，但此酶極容易被誘導(dǎo)、活化，使肝臟含量迅速增加。許多外

6、源性化合物經(jīng)CYP 1A1代謝后可產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，能誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展；CYP 3A4是CYP 450酶系中最重要的亞型, 約占成人肝微粒體CYP450總量的30 ％～40 ％。因此，有必要對(duì)這兩種具代表性的肝藥酶在普萘洛爾對(duì)映體的代謝過(guò)程中的參與情況進(jìn)行研究和探討。 肝細(xì)胞是在人類中檢測(cè)CYP 450 酶活性誘導(dǎo)或抑制最合適的實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)，是最接近臨床的研究系統(tǒng)。普萘洛爾甚少體外藥動(dòng)學(xué)資料，特別是其對(duì)映體的藥代動(dòng)力學(xué)參

7、數(shù)資料。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞作為代謝反應(yīng)系統(tǒng)。對(duì)普萘洛爾對(duì)映體在經(jīng)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中代謝過(guò)程進(jìn)行了研究，其目的是明確肝藥酶CYP 1A1 和CYP3A4 是否參與普萘洛爾對(duì)映體的代謝，并探究其酶動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)的特征，同時(shí)為分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床合理用藥提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)包括四方面的內(nèi)容。 一、肝細(xì)胞培養(yǎng)以及肝藥酶CYP 1A1、CYP 3A4 活性的測(cè)定 目的：采用人肝細(xì)胞作為體外代謝系統(tǒng)，測(cè)定

8、經(jīng)不同濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后酶代謝底物的情況，以此來(lái)描述酶活性的變化，并確定誘導(dǎo)劑的最佳誘導(dǎo)濃度。 方法：通過(guò)肝細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，用MTT 法測(cè)定細(xì)胞存活率；再分別以7-ER 和睪酮為底物，測(cè)定CYP 1A1 和CYP 3A4 的活性變化，以確定BNF 誘導(dǎo)CYP1A1 和RIF 誘導(dǎo)CYP3A4 的最佳濃度。 結(jié)果：BNF 誘導(dǎo)CYP 1A1 的最佳藥物濃度為0.8μmol·L-1，而RIF 誘導(dǎo)CYP 3A4 的最佳藥

9、物濃度為15μmol·L-1。 二、普萘洛爾對(duì)映體的手性拆分 目的：采用光學(xué)純對(duì)映體分別加入細(xì)胞中進(jìn)行代謝，但對(duì)映體在代謝過(guò)程中可能發(fā)生轉(zhuǎn)化，需要將經(jīng)過(guò)代謝后的對(duì)映體進(jìn)行拆分來(lái)驗(yàn)證。 方法：選用GITC 作為柱前衍生化試劑，進(jìn)行對(duì)映體的柱前衍生化，并通過(guò)反相高效液相色譜法檢測(cè)。 結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)的衍生條件下，消旋體可被完全衍生；普萘洛爾對(duì)映體在肝細(xì)胞系統(tǒng)代謝過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，可以直接向肝細(xì)胞中分別

10、加入R(+)-PPL 和S(-)-PPL進(jìn)行代謝，檢測(cè)液無(wú)需再進(jìn)行拆分前處理。 三、HPLC 中檢測(cè)細(xì)胞液中普萘洛爾對(duì)映體的濃度 目的：建立一種用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物濃度的高效、簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)的分析方法。 方法： 1. 反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法定量檢測(cè)普萘洛爾對(duì)映體的濃度。 2. 通過(guò)指定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定萃取回收率、方法回收率和精密度，對(duì)HPLC 方法學(xué)進(jìn)行確證。 結(jié)果：

11、 1. S(-)-PPL 和R(+)-PPL 在測(cè)定范圍內(nèi)(0.5～20μmol·L-1)線性關(guān)系良好，它們的回歸方程分別為Y = 0.5627X + 0.0581 和Y = 0.6699X - 0.2068，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.9993 和0.9994。最低定量濃度（LOD，S/N≥9）均為0.5μmol·L-1。 2. S(-)-PPL 和R(+)-PPL 萃取回收率均大于80％，方法回收率均大于90％。日內(nèi)差

12、均小于8.8％，日間差均小于13.1％。 3. 本方法快捷、準(zhǔn)確、專一性強(qiáng)，可用于細(xì)胞液樣品中的藥物研究。 四、普萘洛爾對(duì)映體的代謝特征 目的：通過(guò)處理酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，考察CYP 1A1 和CYP 3A4 是否參與普萘洛爾的代謝，并且探究對(duì)映體在代謝過(guò)程中的立體選擇性；同時(shí)處理和歸納藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為臨床合理用藥提供參考。 方法： 1. 測(cè)定在BNF 和INF 的誘導(dǎo)下，以及不經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)普萘洛爾酶動(dòng)

13、力學(xué)參數(shù)。 2. 分別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)經(jīng)BNF 和RIF 的誘導(dǎo)以及不經(jīng)誘導(dǎo)空白對(duì)照的普萘洛爾剩余濃度，建立底物濃度-反應(yīng)時(shí)間曲線。 結(jié)果： 1．BNF 誘導(dǎo)的CYP1A1 明顯增強(qiáng)了兩對(duì)映體催化能力，尤其是對(duì)S(-)型對(duì)映體的選擇性。CYPP 3A4 在普萘洛爾的代謝中作用較大, 并表現(xiàn)出對(duì)R(+)-普萘洛爾作用較強(qiáng)的立體選擇性。 2．R(+)-PPL 比S(-)-PPL 的代謝消除快。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后

14、，兩對(duì)映體的代謝均加快。 結(jié)論： 1. 本實(shí)驗(yàn)所選取的兩個(gè)酶均參與了普萘洛爾對(duì)映體的代謝。 2. 肝藥酶CYP 1A1 對(duì)S(-)-PPL 有較強(qiáng)的立體選擇性，而肝藥酶CYP 3A4 則對(duì)R(+)-PPL 有顯著的立體選擇性。 3. R(+)-PPL 比S(-)-PPL 的代謝消除快。誘導(dǎo)CYP 3A4 活性的藥物能顯著增加R(+)-PPL的代謝，而誘導(dǎo)CYP 1A1 活性的藥物能顯著增加S(-)-