普萘洛爾對(duì)映異構(gòu)體的立體選擇性分析與GBLP功能研究.pdf

1、目的 通過(guò)普萘洛爾(Propranolol，Pro)對(duì)映異構(gòu)體(R-Pro、S-Pro)在Caco-2細(xì)胞單層模型上的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究，R-Pro、S-Pro誘導(dǎo)Caco-2、HepG-2和HUVEC細(xì)胞后的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的比較研究，以及對(duì)GBLP進(jìn)行的功能研究，在蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步闡明普萘洛爾手性選擇性的生物學(xué)特征，為探討β1β2受體阻斷劑對(duì)映異構(gòu)體立體選擇性的作用機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 策略與方法 1.Caco-2

2、細(xì)胞單層模型的建立：將Caco-2細(xì)胞接種于Transwell的聚碳酸脂膜上，培養(yǎng)到21～25天時(shí)，通過(guò)測(cè)定跨膜電阻(TEER法)、表觀滲透系數(shù)(熒光黃測(cè)定法)和形態(tài)學(xué)觀察(掃描電鏡和透射電鏡)對(duì)細(xì)胞單層的完整性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。 2.R-Pro和S-Pro吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)：用R-Pro和S-Pro分別處理Caco-2細(xì)胞單層，運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞單層膜兩側(cè)的藥物濃度，評(píng)價(jià)其吸收轉(zhuǎn)運(yùn)方式。 3.運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組分析R-

3、Pro、S-Pro分別作用于Caco-2、HepG-2和HUVEC細(xì)胞后的差異表達(dá)蛋白譜。提取兩種對(duì)映異構(gòu)體作用于三種細(xì)胞后全細(xì)胞蛋白質(zhì)，對(duì)三組細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳分離。通過(guò)優(yōu)化各種條件參數(shù)來(lái)確定合適的上樣量和染色方法。用PDQuet(7.4.0)軟件對(duì)掃描的二維凝膠電泳圖譜時(shí)行分析，篩選出各組細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)。候選差異蛋白斑點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，對(duì)得到的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide massf

4、ingerprinting,PMF)使用Mascot軟件在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)。 4.對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白GBLP用Western blot法和激光共聚焦檢測(cè)GBLP在R-Pro、S-Pro誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞后的表達(dá)情況及細(xì)胞內(nèi)定位。 5.GBLP相互作用蛋白質(zhì)的篩選：提取R-Pro和S-Pro作用HUVEC后的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，用免疫沉淀方法分離與GBLP可以存在相互作用的蛋白質(zhì)；用LC-

5、ESI-MS/MS技術(shù)對(duì)分離得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 1.本課題建立的Caco-2細(xì)胞單層模型，形態(tài)學(xué)檢查可觀察到細(xì)胞融合成連續(xù)而完整的單細(xì)胞層，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞表面覆蓋一層刷狀緣微絨毛，垂直于細(xì)胞表面，并且細(xì)胞具有不對(duì)稱性，這些形態(tài)與小腸上皮細(xì)胞相似；培養(yǎng)21天后測(cè)得的細(xì)胞單層的熒光黃通透系數(shù)Papp(1.0×10 -6cm/s，跨膜電阻TEER)200(Ω*cm2)，說(shuō)明細(xì)胞單層完整性好；建立好的Caco-2

6、細(xì)胞單層模型在Hank平衡鹽溶液(HBSS)中培養(yǎng)8h內(nèi)，Papp值小于1.0×10 -6(cm/s)，TEER值大于200(Ω*cm2)，說(shuō)明細(xì)胞單層模型穩(wěn)定性好。 2.累積2h普萘洛爾對(duì)映異構(gòu)體的表觀通透系數(shù)的結(jié)果顯示，在20-240μmol/L的濃度范圍內(nèi)測(cè)得的Papp值，無(wú)論對(duì)于R-Pro，還是S-Pro，Papp值變化微小，均無(wú)顯著性差異。 3.通過(guò)優(yōu)化條件，最終確定合適的樣品上樣量為100μg、染色方法為銀染。通過(guò)分

7、別對(duì)R-Pro和S-Pro作用Caco-2、HepG-2和HUVEC后的二維凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析，分別發(fā)現(xiàn)約有25個(gè)、30個(gè)和36個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，對(duì)其中25個(gè)、15個(gè)和18個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析后，分別鑒定出了8種、4種和10種可能的差異表達(dá)蛋白。 4.激光共聚焦及Western blot檢測(cè)結(jié)果均表明：GBLP在S-Pro作用后的HUVEC細(xì)胞中表達(dá)明顯低于R-Pro作用后。GBLP定位于細(xì)胞質(zhì)膜

8、與胞漿中。 5.用免疫共沉淀方法在R-Pro和S-Pro作用HUVEC實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中都共分離到了8條蛋白條帶；質(zhì)譜鑒定出了這些條帶中的9個(gè)蛋白，其中7個(gè)蛋白可能為GBLP相互作用蛋白，分別為： Caseinalpha-S1、Casein alpha-S1、Beta casein、Desmoglein 1 precursor、Alphaenolase、Peroxiredoxin 2與Fructose-bisphosphate

9、 aldolase C結(jié)論1.普萘洛爾屬于高通量藥物，主要為被動(dòng)吸收，R-Pro與S-Pro兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體在吸收轉(zhuǎn)運(yùn)方面不存在立體選擇性。 2.鑒定出的差異表達(dá)蛋白可能在R-Pro與S-Pro手性生物學(xué)特征的發(fā)生機(jī)制中起有重要作用。 3.GBLP在R-Pro與S-Pro處理HUVEC細(xì)胞后的表達(dá)存在明顯差異，根據(jù)生物信息學(xué)搜索結(jié)果，推測(cè)：(1)GBLP可能參與了R-Pro與S-Pro手性生物學(xué)效應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；(2)G