病毒樣顆粒構建和治療性降壓疫苗的研究.pdf

1、第一部分噬菌體病毒樣顆粒的制備及改建
　　目的:我們已成功構建了直徑約30nm的Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒(Qβ-2aaVLP)。降壓疫苗強調對Th2型體液免疫應答的誘導,20-200nm范圍內更大直徑的載體可能更利于誘導2型免疫應答;VLP具有良好的內部包裹呈遞能力。為了增強降壓疫苗的免疫效應,對更大直徑VLP的構建及小直徑VLP的改裝就顯得十分必要。本研究將探索性地構建66nm的HK97VLP及其嵌合體,同時研究30nm的A

2、P205VLP對具有免疫刺激或免疫抑制作用的寡聚脫氧核苷酸(ODN)的包裹及其效應。
　　方法:使用全基因合成技術合成HK97噬菌體衣殼蛋白基因(GP4和GP5)并予以擴增,構建雙表達質粒pETDuet-HK97,IPTG誘導gp4和gp5蛋白同時表達并進行自我組裝,利用層析技術純化HK97VLP,體外酸化誘導其成熟,SDS-PAGE判斷其成熟度及純度,在透射電鏡下觀測其形態(tài)大小;全基因合成GP5’基因,構建嵌合體表達質粒pETD

3、uet-HK97-P,用相同技術方案制備嵌合體HK97-PVLP;制備HK97VLP載體疫苗,免疫SD大鼠,與嵌合體疫苗比較對抗體產生的輔助能力。合成AP205VLP衣殼蛋白(CP)基因,構建其表達質粒pET28-AP205,IPTG誘導CP表達及其自我組裝,純化AP205VLP,SDS-PAGE判斷其純度,并在透射電鏡下觀測其形態(tài)大小;將CpGODN2006及ODNA151包裹進AP205VLP內部,驗證其包裹體對脾臟單個核細胞的刺激

4、或抑制效應。
　　結果:成功構建HK97VLP野生型雙表達質粒pETDuet-HK97和嵌合體雙表達質粒pETDuet-HK97-P,均能進行自我組裝成HK97VLP前體,電鏡鑒定其直徑為54nm;體外對前體進行酸化成熟誘導,前體成功膨脹交聯(lián)成成熟體HK97VLP,電鏡鑒定直徑為66nm;野生型耦聯(lián)疫苗與嵌合體疫苗均能強效輔助抗肽抗體的產生,并且前者稍強于后者。質粒pET28-AP205表達AP205VLP成功,SDS-PAGE電

5、泳判斷其分子量正確,予以分離純化后電鏡下鑒定為自行組裝的球形顆粒,直徑約30nm;包裹CpGODN2006的AP205VLP包裹體能直接刺激脾臟單個核細胞γ-IFN的生成,包裹ODNA151的AP205VLP則顯著抑制LPS誘導的脾臟單個核細胞γ-IFN的生成。
　　結論:成功地構建了直徑66nm的HK97VLP和直徑30nm的AP205VLP,并成功地完成了HK97VLP嵌合體的構建及對AP205VLP內部的包裹改裝,提供了更適

6、合更全面的生物靶向治療載體及新型的ODN投遞方式。
　　第二部分治療性腎素降壓疫苗的研究
　　目的:腎素作為RAS系統(tǒng)啟動的關鍵酶分子,在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,是理想的降壓疫苗靶點之一。本研究將設計出數(shù)段針對腎素的短肽,篩選出具有降壓作用的疫苗,從而發(fā)明一段或數(shù)段針對高血壓的腎素短肽疫苗。
　　方法:根據(jù)人腎素晶體衍射結構,采用生物信息學方法,按照以下方案:1)序列氨基酸必須包括腎素催化位點(Asp32和

7、Asp215)之一或“flap”段序列;2)與人類蛋白質組進行相似性比對,選擇相似性低的序列;3)進行親水性及抗原性預測,選擇親水性及抗原性均較好的肽段;4)氨基酸數(shù)目不超過10個。在預實驗基礎上,我們設計了6段短肽序列(rR32、rR72、rR215、hR32、hR72和hR215)作為可能的B細胞表位,用以發(fā)展腎素疫苗。將6段短肽與匙孔血藍素蛋白耦聯(lián)制備疫苗,免疫正常SpragueDawley(SD)大鼠,觀測各肽段的抗體產生及滴度

8、變化趨勢,應用鼠尾血壓計測量大鼠血壓變化,放射免疫分析法(RIA)測定血漿RAS變化狀況。實驗結束后取血并純化各肽段抗體,檢測各抗體與人腎素的結合能力及對血漿腎素活性(PRA)的影響。將篩選出的有效短肽疫苗免疫自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs),觀測其血壓、抗體滴度及RAS的變化狀況,檢測腎臟有無免疫性損害;同時免疫京都Wistar大鼠(WKY),評價疫苗的初步安全性。
　　結果:所有肽段均能產生相應的高滴度抗體,在63天時,SD大鼠的

9、抗血清滴度范圍在1:32,000至1:80,000之間。所有抗血清在體外均可以與人腎素相結合。與對照抗血清及對照抗體相比,rR32、hR32、rR72和hR72肽段組抗血清和純化后抗體均顯著降低PRA(減少50％以上)。ELISA實驗證明抗rR32和抗hR32抗體有著良好的交叉反應性,而抗rR72和抗hR72抗體間交叉性很低。rR32和hR32表位疫苗對SD大鼠的血壓無明顯影響,但是顯著降低SHRs的收縮壓,最高降幅達到15mmHg(1

10、75±2vesus190±3mmHg,P=0.035;180±2vesus195±3mmHg,P=0.039)。免疫組SHRs和WKY大鼠腎臟均未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫性損害。
　　結論:我們率先研制出了一種基于人腎素Asp32催化位點序列的hR32短肽疫苗。hR32短肽疫苗可抑制人腎素活性,顯著降低SHRs血壓,且在動物體內是初步安全的。該疫苗的研究為高血壓的治療提供了新思路和新方法。
　　第三部分ATRQβ-001降壓疫苗的機制

11、研究
　　目的:前期工作中,我們將人血管緊張素II受體1型(AT1R)胞外第二環(huán)的靶點短肽ATR-001與Qβ-2aaVLP載體進行耦聯(lián),成功制備出ATRQβ-001疫苗,該疫苗能夠顯著降低SHRs的血壓并具有良好的靶器官保護效應,但是其確切的降壓及靶器官保護作用機制仍未明了。本研究將探討ATRQβ-001疫苗的降壓及靶器官保護機制。
　　方法:體內試驗中,將ATRQβ-001疫苗免疫SHRs和AngII誘導的Balb/c高

12、血壓小鼠:通過鼠尾血壓計及無線遙測技術觀測血壓;酶聯(lián)免疫吸附試驗測定抗體滴度變化情況;應用心臟超聲及病理技術觀測疫苗對模型動物鼠心肌肥厚及纖維化的影響狀況;應用放射免疫分析法(RIA)測定SHRs血漿RAS的變化情況及心臟和腎臟中AngII的含量;通過qRT-PCR和免疫印跡分析法(WB)分別檢測SHRs心臟和腎臟中腎素和AT1R的mRNA、蛋白表達水平。體外實驗中,使用細胞免疫熒光技術(IF)及RIA檢測抗ATR-001抗體與AT1R

13、的結合能力及抗ATR-001抗體與AngII競爭結合AT1R的能力;通過WB檢測抗ATR-001抗體對腸系膜動脈血管平滑肌(SASMCs)及穩(wěn)定過表達AT1RHEK293細胞系的ERK1/2磷酸化水平的影響;IF檢測抗ATR-001抗體對AngII導致的PKC-α轉位的影響及共聚焦顯微鏡分析對AngII引起的鈣內流升高的影響。
　　結果:ATRQβ-001疫苗能夠有效降低SHRs血壓,最高降幅達到19mmHg(173±2vesus

14、192±3mmHg,P=0.003);降低AngII誘導的高血壓小鼠血壓,最高降幅達到35mmHg(143±4vesus178±6mmHg,P=0.005)。同時,ATRQβ-001疫苗能夠顯著減輕高血壓導致的心肌肥厚和纖維化損傷,具有顯著的靶器官保護作用。與纈沙坦組導致的RAS激活不同,ATRQβ-001疫苗對SHRs血漿RAS無明顯影響,未見RAS的反饋激活,左室心肌和腎臟皮質AngII的濃度三組中均未檢測到明顯差異。ATRQβ-0

15、01疫苗亦顯著降低心臟和腎臟中AT1RmRNA和蛋白表達水平。纈沙坦顯著增加腎臟腎素的mRNA表達水平,而ATRQβ-001疫苗對其表達未有明顯影響。體外實驗中,抗ATR-001抗體能夠與SASMCs及穩(wěn)定過表達AT1RHEK293細胞系上AT1R結合,不與AngII競爭結合AT1R。但是,抗ATR-001抗體顯著抑制AngII刺激引起的SASMCs及穩(wěn)定過表達AT1RHEK293細胞系ERK1/2磷酸化水平(72%降低,P=0.013