人細(xì)小病毒B19病毒樣顆粒的制備.pdf

1、B19屬于細(xì)小病毒科紅病毒屬。對(duì)于免疫功能正常的人群，B19主要引起兒童傳染性紅斑（又稱第五?。┖统扇祟愶L(fēng)濕樣急性多關(guān)節(jié)?。欢鴮?duì)于免疫力低下者，感染B19會(huì)引起單純紅細(xì)胞再生障礙及慢性貧血；對(duì)于孕婦，B19感染嚴(yán)重時(shí)可致胎兒水腫，宮內(nèi)死胎等。B19病毒主要經(jīng)呼吸道傳播，也可通過輸血傳播和母嬰傳播。 由于國內(nèi)目前還沒有商品化的B19檢測試劑，有必要建立B19的血清學(xué)檢測方法。血清B19IgG檢測可用于發(fā)現(xiàn)既往感染；另外輸注B19I

2、gG陽性的血液，有利于防止B19的輸血傳播。B19病毒IgM抗體檢測方法可用于急性感染的診斷。 建立抗體檢測的血清學(xué)檢測方法需要有足量的病毒抗原，B19目前在體外難以培養(yǎng)，病毒抗原的制備只能采用基因工程的方法。B19衣殼由VP1和VP2兩種蛋白組成，VP2占96％。VP2在哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠自我組裝成形態(tài)結(jié)構(gòu)及免疫原性均與天然病毒粒子相似的病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLPs），能有效地結(jié)合構(gòu)

3、象型抗體，是用于血清抗體檢測的理想抗原。 本研究擬通過原核和昆蟲細(xì)胞表達(dá)B19VP2蛋白制備VLPs，B19VLPs的制備將為B19病毒的血清學(xué)檢測方法的建立打下基礎(chǔ)。 一、Sf9細(xì)胞中表達(dá)VP2蛋白及B19病毒樣顆粒的制備實(shí)驗(yàn) 目的：在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)B19VP2蛋白，制備VLPs。 方法：設(shè)計(jì)合成60條引物，PCR為基礎(chǔ)的兩步DNA合成方法（PCR-basedtwo-stepDNAsynthesi

4、s，PTDS）人工合成VP2基因編碼區(qū)，末端加A后連接至pMD18-T載體，得到質(zhì)粒pMD-VP2。NdeI/XhoI從pMD-VP2質(zhì)粒切下VP2基因，亞克隆到pFast-BacI載體，轉(zhuǎn)化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的E．coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得的重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-VP2；在脂質(zhì)體（CellfectinReagent）介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，包裝重組桿狀病毒rBac-VP2，測定rBac-VP2滴度

5、。10MOI（感染復(fù)數(shù)）rBac-VP2感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞病變明顯，收取Sf9細(xì)胞，少量用于間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（lFA）、Westernblotting方法鑒定VP2蛋白表達(dá)情況，剩余部分超聲破碎，上清采用蔗糖墊層超速離心及非連續(xù)CsC1密度梯度超速離心方法分離純化。純化產(chǎn)物經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后電鏡觀察病毒樣顆粒的形成情況。 結(jié)果：成功構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-VP2，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后包裝出重組桿狀病毒rBac-VP2，

6、滴度2．5×107IU/ml。10MOIrBac-VP2感染Sf9細(xì)胞，IFA及Westernblotting檢測表明VP2得到表達(dá)。超速離心純化后，于CsC1密度為1．20g/ml處的蛋白層中能觀察到大小約22nm的VLPs。 結(jié)論：利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了細(xì)小病毒B19VLPs。 二、VP2蛋白的原核表達(dá)實(shí)驗(yàn) 目的：通過原核表達(dá)B19VP2制備VLPs。 方法：酶切pMD-VP2將VP2基因以不同方

7、法亞克隆到pET-30a（+）載體，得到pET-VP2（表達(dá)完整VP2蛋白）或pET-HVP2（表達(dá)N端融合His標(biāo)簽的VP2），轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)；或?qū)P2基因亞克隆到pBV220載體，得pBV-VP2，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，通過改變培養(yǎng)溫度誘導(dǎo)表達(dá)完整蛋白。無標(biāo)簽的VP2包涵體在變性、復(fù)性后使用DEAE瓊脂糖陰離子交換柱純化；帶His標(biāo)簽的VP2在變性條件下使用固化金屬層析柱純

8、化；十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和Westernblotting分析純化后的蛋白。電鏡負(fù)染技術(shù)用于檢測VLPs的形成。 結(jié)果：合成得到VP2基因的編碼區(qū)，并成功構(gòu)建質(zhì)粒pET-VP2、pET-HVP2及pBV-VP2。SDS-PAGE結(jié)果表明VP2目的蛋白以包涵體形式表達(dá)；包涵體變性、復(fù)性并經(jīng)多種層析方法處理后，目標(biāo)蛋白均未得到純化；電鏡觀察也未見VLPs。Westernblotting結(jié)果可見多數(shù)蛋白條

9、帶均能與B19VP2抗體特異性結(jié)合，它們可能是VP2的不同截短體。 結(jié)論：在原核細(xì)胞VP2蛋白以包涵體形式表達(dá)，產(chǎn)量高，變性后復(fù)性操作容易；但原核表達(dá)可能產(chǎn)生了多種VP2截短體，給純化和VLPs的自組裝造成困難。雖然未得到純化的VP2蛋白及其VLPs，但原核表達(dá)的實(shí)踐為我們進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指明了方向。 綜上所述，我們合成細(xì)小病毒B19衣殼蛋白VP2基因編碼區(qū)，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒及重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒，在細(xì)菌或昆蟲細(xì)胞中