人微小病毒B19感染與結(jié)腸腺癌關(guān)系的初步研究.pdf

1、研究背景及目的：人微小病毒B19 感染是一個(gè)全球關(guān)注的問題，約半數(shù)的兒童和60％以上的成人血清學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性，其感染率在美國(guó)、歐洲及亞洲相似。 大量研究表明越來越多的疾病發(fā)生與B19感染有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)B19在急性淋巴母細(xì)胞性白血病和髓系白血病的發(fā)病中起重要作用。該病毒基因VP1獨(dú)特區(qū)(VP1u) 的重組蛋白與人滑膜細(xì)胞孵育后可顯著上調(diào)環(huán)氧合酶-2 的表達(dá)，而后者通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生、血管生成、細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡等多種途徑在

2、腫瘤的發(fā)生中起重要作用。但迄今為止幾乎沒有B19感染與實(shí)體腫瘤發(fā)病的相關(guān)性研究。本研究旨在探討該普遍感染人類的病原體—人微小病毒B19，是否在結(jié)腸腺癌中表達(dá)及其在結(jié)腸腺癌發(fā)病中可能的作用機(jī)制。 方法: 運(yùn)用巢式-PCR、原位雜交和免疫組織化學(xué)方法在119 例石蠟包埋的結(jié)腸息肉、結(jié)腸腺癌、癌旁組織和正常結(jié)腸組織標(biāo)本中檢測(cè)B19 病毒DNA 和蛋白。將該病毒在各組織中檢測(cè)的陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；隨機(jī)選取10 例配對(duì)標(biāo)本（腺癌組織和

3、其對(duì)應(yīng)的癌旁組織）用于顯微切割以獲取組織成分均一的細(xì)胞，進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增B19 DNA 并測(cè)序；免疫組化方法檢測(cè)B19 衣殼蛋白和環(huán)氧合酶-2 在37 例結(jié)腸腺癌中的表達(dá)的相關(guān)性分析；構(gòu)建含VP1u 基因的四環(huán)素可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染Lovo 結(jié)腸癌細(xì)胞系， western-blot 分析該基因的蛋白表達(dá)對(duì)環(huán)氧合酶-2 蛋白的影響。 結(jié)果: 運(yùn)用巢式PCR 方法在各組織中檢測(cè)B19 DNA的陽(yáng)性率分別為：結(jié)腸腺癌94.6％

4、(35/37)、癌旁組織67.6％ (25/37)、結(jié)腸息肉85.6％ (30/35)和正常對(duì)照60.0％ (6/10)。顯微切割結(jié)果顯示10例結(jié)腸腺癌組織中B19DNA均為陽(yáng)性（10/10），而與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織內(nèi)僅有3例（3/10）為陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)了病毒DNA主要存在于結(jié)腸腫瘤性上皮細(xì)胞內(nèi)。在各組織中運(yùn)用原位雜交方法檢測(cè)B19 DNA的陽(yáng)性率分別為：結(jié)腸腺癌81.1％ (30/37)、癌旁組織43.2％(16/37)、結(jié)腸息肉74

5、.3％ (26/35) 和正常對(duì)照50.0％ (5/10)。B19病毒衣殼蛋白表達(dá)分別在結(jié)腸腺癌為78.4％ (29/37)、癌旁組織32.4％ (12/37)和結(jié)腸息肉57.1％ (20/35)，但是正常結(jié)腸組織內(nèi)沒有一例蛋白表達(dá)陽(yáng)性（0/10）。巢式PCR、原位雜交和免疫組化結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示B19的DNA和蛋白在結(jié)腸腺癌和癌旁組織（P = 0.012，P < 0.001，P < 0.001），腺癌和正常對(duì)照組織（P = 0.01

6、4，P = 0.017，P < 0.001）中均存在顯著性差異。巢式PCR和原位雜交檢測(cè)結(jié)果在結(jié)腸息肉和正常組織對(duì)照間僅表現(xiàn)微弱趨勢(shì)，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P = 0.093，P = 0.062），然而，免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)B19衣殼蛋白的表達(dá)在結(jié)腸息肉和正常對(duì)照間存在顯著性差異（P = 0.001）。對(duì)37例結(jié)腸腺癌組織中環(huán)氧合酶-2和B19衣殼蛋白VP1的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析提示，環(huán)氧合酶-2和B19衣殼蛋白VP1的表達(dá)具有顯著相關(guān)性（P

7、 =0.001，κ=0.539）；將含該病毒VP1u基因的四環(huán)素可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞系后，在四環(huán)素誘導(dǎo)下，western-blot 分析顯示VP1u蛋白在第12 h后開始表達(dá)，于48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰，并且發(fā)現(xiàn)VP1u蛋白的表達(dá)可上調(diào)環(huán)氧合酶-2蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：微小病毒B19 DNA 普遍存在于人結(jié)腸組織中，其病毒衣殼蛋白的表達(dá)主要定位于結(jié)腸息肉和腺癌組織內(nèi)。B19 病毒可能通過VP1u 上調(diào)環(huán)氧合酶-2