桿狀病毒系統(tǒng)中地方株輪狀病毒蛋白的重組表達及病毒樣顆粒的構(gòu)建.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文桿狀病毒系統(tǒng)中地方株輪狀病毒蛋白的重組表達及病毒樣顆粒的構(gòu)建姓名：李國華申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：錢淵2001.10.1中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文免疫原性，獲得抗輪狀病毒保護效果。通過自聚合過程，重組表達的VP2、VP6、VP7蛋白可以形成一穩(wěn)定的三層病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。動物實驗表明這種病毒樣顆粒能夠提供抗輪狀病毒感染的保護。雖然輪狀病毒活疫苗的研究取得了很大進展，但研究人員仍

2、在試圖找到一種更合適有效的疫苗。對重組輪狀病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)、功能及免疫學(xué)方面的大量研究使人們認識到用重組表達方法獲得的病毒樣顆粒有可能作為亞單位疫苗獲得應(yīng)用。以重組病毒樣顆粒為疫苗具有諸多優(yōu)點：1可以構(gòu)建包含不同的GfliP血清型的重組病毒樣顆粒，2不需要使用可能影響抗原性的滅活試劑，3可以誘導(dǎo)針對更多種異型病毒的抗體，4非復(fù)制顆粒不可能發(fā)生病毒間的重組現(xiàn)象，使用安全。目前對輪狀病毒病毒樣顆粒的研究大都使用桿狀病毒表達系統(tǒng)，作為真核表達

3、體系，該系統(tǒng)具備表達蛋白的加工和修飾能力，此，夕該系統(tǒng)發(fā)展成熟，表達產(chǎn)＼／量相對較高，操作簡便，易于放大制備。硝本研究在桿狀病毒表達系統(tǒng)首先進行了VP6；UVP7蛋白的重組表達。PCR方法擴增A組輪狀病毒我國地方株T114VP6基因及T73G1型VP7基因，分別克隆于桿狀病毒表達載體pBlueBac與分泌表達載體pMelBac中，構(gòu)建成重組表達載體pBlueBac—VP6、pMelBac—VP6、pBlueBac—VP7、pMelBac

4、—VP7cut51aa；重組載體與桿狀病毒線性DNA共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞?？瞻邔嶒灪Y選重組病毒，病毒擴增放大制備高滴度的第三代重組病毒，重組病毒感染Sf9細胞制備樣品，用豚鼠抗輪狀病毒wa株高價免疫血清經(jīng)Westernblot方法檢測四種重組病毒VP6、VP7蛋白的表達。含標準株VP2、地方株T114VP6年[J地方株T7361型VP7蛋白編碼基因的重組病毒以05MOI共感染Sf9細胞制備2／6／7病毒樣顆粒，待細胞完全裂解后收獲培養(yǎng)基