表達(dá)人呼吸道合胞病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組腺病毒及桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的:人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)廣泛分布于世界各地,是導(dǎo)致嬰幼兒、老年人和免疫缺陷病人嚴(yán)重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。RSV屬于副粘病毒科肺病毒屬,基因組為15.2 Kb的單股負(fù)鏈RNA,編碼11種蛋白,其中黏附蛋白(Glycoprotein,G)和融合蛋白(Fusion protein,F)為RSV主要中和抗原,基質(zhì)蛋白(Matrix protein,M)為RSV

2、的骨架蛋白。從福爾馬林滅活疫苗開(kāi)始,已研制了多種形式的RSV疫苗,但由于安全性和免疫原性等問(wèn)題,至今尚沒(méi)有能夠用于預(yù)防人RSV感染的疫苗問(wèn)世。病毒樣顆粒疫苗作為一種新型疫苗形式被廣泛用于各種病毒疫苗研制,并獲得較為理想的免疫效果和保護(hù)作用。迄今為止,人們對(duì)于RSV病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)的制備條件尚處探索階段,僅有的一個(gè)關(guān)于RSV VLPs見(jiàn)于2008年美國(guó)一份專利申請(qǐng)書(shū),但存在產(chǎn)量低、制備困難及

3、未見(jiàn)免疫效果和免疫保護(hù)作用研究。本研究擬選用非復(fù)制型第一代腺病毒載體(First generation replication deficient recombinantadenoviral vector,FGAd)和桿狀病毒表達(dá)載體分別構(gòu)建表達(dá)RSV F、G、M的復(fù)制缺陷型重組腺病毒及重組桿狀病毒,為進(jìn)一步闡明RSV VLPs形成和出芽機(jī)制,以及獲得RSV VLPs奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:參考GenBank登錄的RSV A

4、亞型Long株M、G蛋白基因序列,按照哺乳動(dòng)物細(xì)胞密碼子偏性,對(duì)M和G基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,然后分別克隆到穿梭載體pShuttle-CMV,再經(jīng)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,獲得重組腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-Msyn,Western-blot鑒定目的基因表達(dá)。參考GenBank登錄的RSVA亞型Long株F、G和M蛋白基因序列,按照昆蟲(chóng)細(xì)胞密碼子偏性,對(duì)F、G和M基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,然后分別克隆到穿梭載體pFa

5、st-BacI,轉(zhuǎn)座后獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt,Western-blot鑒定目的基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:重組腺病毒DNA分子轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,7d左右細(xì)胞出現(xiàn)腫脹,圓縮等典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),Western blot檢測(cè)到G和M基因的表達(dá),獲得非復(fù)制型重組腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-M

6、syn。重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后,3d后出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核增大和核內(nèi)出現(xiàn)空泡等病變,Western blot檢測(cè)到F、G和M基因的表達(dá),獲得重組桿狀病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt。
　　 結(jié)論:成功獲得FGAd-Gsyn、FGAd-Msyn、rBac-Fopt、rBac—Mopt和rBac-Gopt,為闡明RSV VLPs形成和出芽機(jī)制,以及獲得RSV VLPs奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。