呼吸道合胞病毒的病毒樣顆粒疫苗制備及其感染導(dǎo)致肺損傷機(jī)制研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是全球新生兒與老年人最為常見的呼吸道疾病病原之一。70％以上的RSV患兒是5歲以下的兒童，其中10％因下呼吸道感染（LRTI）而入院治療。自上世紀(jì)60年代，全球科學(xué)家不遺余力地研制RSV疫苗，遺憾的是市場上至今沒有認(rèn)證的預(yù)防疫苗。由此，WHO要求世界各國做好防控RSV的工作。
　　1956年，Blount課題組首次發(fā)現(xiàn)黑猩猩鼻炎分泌物(CCA)的合胞病

2、毒。第二年，Chanock等人報道CCA可感染嬰幼兒及兒童引發(fā)支氣管炎，并將CCA分離，發(fā)現(xiàn)其感染細(xì)胞后出現(xiàn)大片融合現(xiàn)象，因此命名為呼吸道合胞病毒(RSV)，屬于副黏病毒科RNA病毒。其基因組大小為15kb，編碼11個蛋白。其中表面糖蛋白F、G為主要保護(hù)性抗原，包括絕大部分中和抗體表位及T細(xì)胞抗原決定簇。保守性F蛋白主要誘導(dǎo)CTL，促進(jìn)CD4+與CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，活化Th1免疫應(yīng)答。特異性G蛋白可誘導(dǎo)Th2偏向性免疫應(yīng)答，依據(jù)G蛋白將

3、RSV分為A和B群兩個血清亞型。臨床上，RSV呈現(xiàn)交替的優(yōu)勢流行。
　　早在上世紀(jì)70年代，采用甲醛滅活研制的FI-RSV疫苗不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)。且80％受試患嬰出現(xiàn)免疫增強(qiáng)性疾病(VED)入院治療，甚至導(dǎo)致2名患兒嬰死亡而終止臨床研究。隨后采用傳代培養(yǎng)、臨床分離、基因改造方法研制的RSV減毒活疫苗，具備良好的免疫原性及保護(hù)性，其潛在的病毒安全性備受爭議而止步于二期臨床研究。接著采用基因重組制備的F、G蛋白亞單位疫苗，如BBG2N

4、a進(jìn)入三期臨床試驗，因保護(hù)不全面停止后續(xù)研究。另外，采用HPIV、ADV為載體研制的重組載體疫苗進(jìn)入臨床試驗研究，因載體病毒具有預(yù)存免疫應(yīng)答（pre-exsiting immunology,PEI）終止試驗。由此可見，RSV疫苗研究困難重重，亟需解決如下問題:1）RSV抗原表位完整性;2）機(jī)體Th1與Th2免疫應(yīng)答失衡導(dǎo)致VED;3）減毒潛在的危險;4）PEI導(dǎo)致的CTL應(yīng)答削弱。
　　近年來，病毒樣顆粒(VLP)組裝技術(shù)日益成熟

5、，其優(yōu)勢逐漸凸顯。它是類似病毒自然形態(tài)的蛋白顆粒，模擬自然感染過程。因其缺乏核酸物質(zhì)無復(fù)制、重組、傳播能力，提高了安全性。現(xiàn)已有研究借助流感M蛋白實現(xiàn)VLP組裝，臨床前動物試驗具有良好的效果。但流感載體存在PEI，加大VED的風(fēng)險?？梢姡x擇無PEI的病毒基質(zhì)蛋白應(yīng)用于RSV VLP組裝是發(fā)展疫苗的前提。我們所知，新城疫病毒(NDV)是不易感染人的禽源病毒，且基質(zhì)蛋白M、NP的VLP形成率較高。另外，NDV與RSV同屬副黏病毒屬，具有一

6、定的同源性，易于組裝。由此可見，NDV的骨架蛋白是RSV形成VLP最佳載體。
　　RSV是經(jīng)過粘膜，感染入侵人體。那么，粘膜免疫產(chǎn)生的sIgA可直接中和病毒，快速阻止其擴(kuò)散和傳播。同時，它也可活化系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生IgG中和抗體和CTL細(xì)胞應(yīng)答，有效地保護(hù)機(jī)體。另外，其免疫方式（滴鼻或無針注射）具有無痛優(yōu)勢，適用于嬰幼兒。由此可見，粘膜免疫在RSV的防護(hù)中發(fā)揮不可替代作用。
　　現(xiàn)今，用于臨床治療RSV感染的藥物僅有Pal

7、ivizumb和Ribavirin，可有效治療RSV引起的肺炎支氣管炎。但Palivizumb需反復(fù)注射才能達(dá)到治療效果，且費用昂貴。而Ribavirin具有副作用，不適用于免疫缺陷人群。因此，研制開發(fā)新型RSV治療藥物并完善其治療策略對防控RSV感染意義重大。
　　RSV致病機(jī)制對于其預(yù)防疫苗及治療藥物設(shè)計至關(guān)重要。迄今為止，RSV感染致病研究主要集中在RSV免疫逃逸機(jī)制、宿主免疫損傷及炎癥效應(yīng)。感染初期，RSV(NS1、NS2

8、、G)可阻礙TLR信號通路，抑制IFN-Ⅰ型應(yīng)答，避免天然免疫的抗病毒攻擊，完成自我復(fù)制，傳播至下呼吸道誘發(fā)肺部疾病。同時，大量RSV聚集活化TLRs、RIG-Ⅰ，誘導(dǎo)促炎基因表達(dá)，產(chǎn)生大量的IL-2、IL-6、TNF-α、CCL2、CCL3、IP-10等招募激活免疫細(xì)胞，侵入肺組織，造成肺部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致?lián)p傷。現(xiàn)有研究表明RSV感染導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與其致病機(jī)制密切相關(guān)。RSV致病過程復(fù)雜，影響因素眾多，亟需深入探究。而尋找到宿主的易感基因

9、及致死基因可為闡明RSV致病機(jī)制提供大量的試驗素材。
　　本研究立足于研發(fā)新型VLP疫苗、尋找藥物靶標(biāo)及提出創(chuàng)新理論體系，開展如下兩部分研究:
　　重組RSV VLP疫苗的制備及免疫效果的初步研究
　　實驗?zāi)康?制備及評價重組RSV-VLP蛋白疫苗，為獲得RSV候選疫苗提供有力試驗證據(jù)。
　　實驗方法:選擇NDV為骨架，嵌合RSV的F和G蛋白，利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備重組RSV-VLP蛋白疫苗并進(jìn)行初步評價。首先將目

10、的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，其次按照M-NP-F或M-NP-G順序相連，且兩兩之間加入SV40與polyhedron啟動子，插入載體pFastBacⅠ。當(dāng)雙酶切、PCR鑒定構(gòu)建成功后，將其桿粒轉(zhuǎn)入sf9獲得穩(wěn)定表達(dá)桿狀病毒，采用WB、電鏡證明VLP成功組裝。接下來，經(jīng)密度梯度離心純化后，滴鼻免疫小鼠，采用ELISA、ELISPOT對其免疫原性進(jìn)行評價。攻毒后，觀察小鼠體重、肺部病理及病毒載量指標(biāo)，對VLPs免疫保護(hù)性進(jìn)行評價。
　　實驗

11、結(jié)果:Westernblot檢測出RSV表面蛋白60KD的G蛋白和56KD的F蛋白，同時也發(fā)現(xiàn)骨架蛋白51KD的NP和40KD的M均有表達(dá)，電子顯微鏡觀察VLPs顆粒大小均一，NDV-VLP-G直徑集中在91-110nm; NDV-VLP-G直徑分布較大，約為51-130nm。上述結(jié)果證明VLPs組裝成功。小鼠評價試驗證實:混合劑型rNDV/RSV/F+G免疫小鼠產(chǎn)生的系統(tǒng)性體液免疫、粘膜免疫及細(xì)胞免疫效果均優(yōu)于單一（rNDV/RSV/

12、F或rNDV/RSV/G）免疫劑型。小鼠保護(hù)性試驗證實:rNDV/RSV/F+G可以緩解小鼠體重下降，降低肺鼻的病毒載量，更重要的是能夠減少肺泡細(xì)胞炎癥因子的侵入，改善肺組織的纖維化，消除肺部的病灶，有效地保護(hù)小鼠。
　　實驗結(jié)論:成功制各重組NDV-RSV VLPs，證實其能夠激活系統(tǒng)及粘膜免疫應(yīng)答，無VED。其中聯(lián)合免疫劑型rNDV/RSV/F+G的免疫保護(hù)效果均優(yōu)于單一免疫劑型，可能成為RSV潛力候選疫苗株，為其探究提供了試

13、驗數(shù)據(jù)。
　　RSV感染肺損傷機(jī)制研究
　　實驗?zāi)康?建立siRNA篩選平臺，尋找RSV易感及致死基因，探究其功能，為RSV感染致病機(jī)制提出新理論體系，同時也為RSV防治提供候選藥物靶標(biāo)。
　　實驗方法:篩選siRNA文庫，獲得有效基因，隨后進(jìn)行功能研究。首先，利用siRNA文庫，通過MTS方法檢測病毒感染后細(xì)胞活力變化，篩選RSV感染致死相關(guān)基因，獲得有效基因ACE2及MSK-2并繼續(xù)研究。接著通過收集臨床樣品，利用

14、Westernblot、ELISA檢測AngⅡ、ACE2和ACE變化，通過體重變化、肺濕干比、病理變化完善小鼠肺損傷模型，深入探究ACE2功能。同時，通過Westernblot檢測LC3Ⅱ含量轉(zhuǎn)化率，激光共聚焦技術(shù)觀測自噬小體變化建立RSV誘導(dǎo)自噬模型，結(jié)合siRNA敲除、抑制劑試驗，開展MSK-2的功能驗證工作。
　　實驗結(jié)果:成功建立篩選平臺，已篩選文庫基因達(dá)4000個，成功獲得3個保護(hù)基因和10個致死基因。其中ACE2及MS

15、K-2效果顯著且穩(wěn)定，進(jìn)行深入研究。經(jīng)過臨床標(biāo)本檢測及小鼠實驗證明:ACE2在RSV感染導(dǎo)致肺損傷發(fā)揮重要作用。RSV感染過后ACE2降低影響血管緊張素2受體1(AT1R)變化進(jìn)而加重肺損傷。同時ACE2重組蛋白能夠有效地緩解RSV導(dǎo)致的肺損傷，為RSV防治提供了有效地藥物靶標(biāo)。通過RSV感染自噬模型的研究發(fā)現(xiàn)，MSK-2可能通過調(diào)節(jié)LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化率參與調(diào)控RSV感染誘導(dǎo)的自噬，其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探究。
　　實驗結(jié)論:人類全基因組