呼吸道合胞病毒的納米免疫分析新方法研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬于副粘病毒科肺病毒屬，是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染的最常見病原體之一。在美國，據(jù)統(tǒng)計，每年有85000～144000的嬰兒因病毒性肺炎或毛細(xì)支氣管炎接受住院治療。除此之外，某些老年人群和免疫功能缺陷的成年人群也是RSV感染的主要對象。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)顯示，全球每年的呼吸道合胞病毒感染者約有6400萬例，而其中16萬例因感染并發(fā)癥死亡。

2、經(jīng)過幾十年的努力，到目前為止依舊沒有安全、有效的疫苗可用于RSV感染的預(yù)防。因此，建立簡單、快速、靈敏的RSV實(shí)驗(yàn)室檢測方法，對疾病的早期診斷、治療以及預(yù)防控制都具有非常重要的意義。
　　呼吸道合胞病毒的檢測方法主要基于三個方面:一是病毒的分離培養(yǎng);二是病毒核酸的檢測，三是病毒抗原或抗體的分析。雖然用組織培養(yǎng)分離病毒是目前診斷的最好方法或稱為金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)周期長，敏感性差，操作復(fù)雜，不適于大量檢測。而病毒核酸檢測方法靈敏度高、快

3、速，并且能同時分析大批量樣本，但卻需要價格昂貴的精密儀器和專業(yè)的技術(shù)人員操作，不適于普通實(shí)驗(yàn)室或戶外檢測。免疫檢測技術(shù)因其特異性強(qiáng)、方法簡單等優(yōu)勢，在病毒抗原或抗體的檢測中得到廣泛的應(yīng)用。不過，由于靈敏度低，很難用于臨床RSV感染的早期診斷。為了解決上述問題，以實(shí)現(xiàn)RSV的高靈敏、簡操作、低成本、可視化分析，本文將貴金屬納米顆粒及金/石墨烯納米復(fù)合物引入免疫分析技術(shù)，建立了一系列高靈敏的RSV檢測新方法。具體的研究工作如下:
　　

4、1.金銀納米顆粒在RSV免疫分析中的應(yīng)用
　　(1)利用酶反應(yīng)產(chǎn)物作為信號分子的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）免疫分析。銀納米顆粒(AgNPs)是常用的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)活性基底。本文利用抗壞血酸及檸檬酸共還原氯化銀溶膠法制得分散性好且SERS活性強(qiáng)的AgNPs，并將其用于RSV的免疫分析中。在該免疫學(xué)反應(yīng)體系中，辣根過氧化物酶(HRP)在H2O2存在下催化底物TMB失去電子，得到氧化產(chǎn)物TMB+。溶液中成離子狀態(tài)的TMB

5、+與帶負(fù)電AgNPs發(fā)生相互作用，化合物被吸附到AgNPs表面，產(chǎn)生強(qiáng)烈的SERS信號，實(shí)現(xiàn)對RSV的靈敏檢測。相較于傳統(tǒng)的ELISA顯色法，靈敏度提高50倍。另外，由于酶催化TMB顯色反應(yīng)被廣泛用于生化分析領(lǐng)域，因此利用酶反應(yīng)產(chǎn)物的SERS分析策略具有普適性。
　　(2)金納米粒子信號放大高靈敏度的檢測RSV。金納米粒子(AuNPs)因具有合成簡單、比表面積大、負(fù)載效率高、性能穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生化分析領(lǐng)域。

6、本文利用AuNPs作為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體的載體，以HRP催化H2O2氧化TMB的吸光度值來檢測RSV。由于AuNPs較大的比表面積可以增加酶標(biāo)抗體在其表面的吸附量，所以同傳統(tǒng)的ELISA相比，檢測信號增強(qiáng)，最低檢出濃度可以達(dá)到0.5 pg/mL。另外該方法重復(fù)性好，選擇性強(qiáng)，構(gòu)建的免疫體系在3個星期內(nèi)都能夠穩(wěn)定存在，具有很好的應(yīng)用價值。
　　(3)結(jié)合金納米層（GNPL）修飾的微孔板及酪胺信號放大(TSA)技術(shù)，建立

7、雙信號放大策略實(shí)現(xiàn)對RSV的高靈敏檢測。在H2O2存在時，一些氧化酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）可以將底物酪胺催化后共價結(jié)合到周圍蛋白的富電子表面形成酪胺化復(fù)合物，大量富集成以酶為中心的類似“樹”狀的聚集團(tuán)，當(dāng)對酪胺進(jìn)行一定標(biāo)記后，可以將原始信號幾何級放大。本文以RSV為代表，首先采用化學(xué)鍍金的方式在微孔板表面制備金納米層，改善微孔對捕獲抗體的吸附能力，提高檢測靈敏度;再利用TSA技術(shù)使HRP大量沉積，催化底物TMB顯色，進(jìn)一步放大

8、檢測信號，實(shí)現(xiàn)RSV的高靈敏度分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，方法在0.05～30 pg/mL范圍之間對RSV的響應(yīng)具有良好的線性關(guān)系。另外，將RSV分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和人血清，回收率在90.6％～98.1％，說明該方法可用于復(fù)雜樣品中RSV的分析測定。
　　2.金/石墨烯復(fù)合納米材料在RSV免疫分析中的應(yīng)用
　　(1)利用Hg2+增強(qiáng)AuNPs/graphene模擬酶活性實(shí)現(xiàn)對RSV的色度免疫分析.據(jù)報道，納米材料包括碳納米材料

9、、貴金屬納米顆粒、氧化鐵納米顆粒等都具有類似過氧化物酶的催化活性，即在H2O2存在下，能夠催化TMB等辣根過氧化物酶的底物發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化。但是當(dāng)有生物分子比如蛋白質(zhì)、DNA吸附后，催化活性被完全抑制，限制了這類納米材料在分析化學(xué)中的應(yīng)用。本研究通過鞣酸一步合成AuNPs/graphene復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物具有模擬酶的性質(zhì)，添加Hg2+可以顯著增強(qiáng)其酶活性，即使是生物分子完全抑制其催化能力后?；诖耍SV的色度免疫分析

10、新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)RSV濃度在0.1～10 pg/mL的濃度范圍內(nèi)時，吸收值與RSV濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢出濃度為0.04pg/mL。
　　(2)利用石墨烯和羥胺還原放大技術(shù)，建立超靈敏的等離子免疫分析方法用于病原體的檢測。Graphene由于具有高的表面積，大量的金納米粒子可以在其表面沉積;同時因?yàn)榻鸺{米顆粒能高效催化HAuCl4-NH2OH氧化還原反應(yīng)，使Au原子沉積到AuNPs表面，導(dǎo)致AuNPs的尺寸由小變大

11、。基于此，建立一種超靈敏的RSV等離子免疫分析方法。首先，通過簡單的水熱法一步合成AuNPs/graphene納米復(fù)合物，利用AuNPs和graphene均易吸附蛋白的優(yōu)點(diǎn)，將抗體修飾于AuNPs/graphene雜合體表面，并加入由固相載體-RSV組成的微孔中形成三明治結(jié)構(gòu)，此時加入HAuCl4-NH2OH溶液，微孔溶液的顏色發(fā)生變化，通過肉眼便可讀出結(jié)果，特別適合于資源有限的地區(qū)。
　　總之，本論文以金銀納米顆粒或金/石墨烯復(fù)