豬O型口蹄疫病毒細菌樣顆粒載體疫苗的初步研究.pdf

1、口蹄疫(Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引發(fā)的偶蹄獸的急性、烈性的傳染病，嚴重阻礙了畜牧業(yè)的健康發(fā)展。滅活苗接種是中國控制豬O型口蹄疫的主要手段，但滅活疫苗存在免疫期短，誘導的細胞免疫應答水平不高，生產成本高等不足。因此，研制新型有效的豬O型FMDV疫苗具有重要意義。
　　已有文獻報道GEM顆粒(Gram-positive bacterial enhancer matrix particles，

2、革蘭氏陽性細菌增強子基質顆粒)表面展示系統(tǒng)具有特異性吸附并純化與乳酸菌錨構蛋白PA3融合表達的外源可溶性蛋白，提高其免疫原性的作用。亦已探明VPl141-160、VPl200-213和3A21-35分別是O型FMDV的保護性B細胞表位、Th2細胞表位和Th1細胞表位。對此，本研究以上述3個表位設計多表位肽并展示在GEM顆粒表面，制備細菌樣顆粒疫苗并驗證其免疫效果。主要研究內容與結果如下:
　　首先，構建含F(xiàn)MDV抗原表位的原核表達

3、重組質粒。以Epi141-160、Epi200-213和Epi21-35設計3種不同形式的多表位串聯(lián)肽，即TB(140～160aa-GG-200～213aa)、BTTB(140～160aa-GG-200～213aa-GG-21～35aa-GG-140～160aa)及VP1*C(VP1全基因序列，將158位的P替換為C)，并委托生物公司將其克隆入pUC57載體。將多表位串聯(lián)肽基因與表達質粒pQZ-PA3進行酶切連接，構建原核表達重組質粒p

4、QZ-TB-PA3、pQZ-BTTB-PA3、pQZ-VP1*C-PA3。重組質粒經IPTG誘導表達后獲得3種可溶性融合蛋白(rTB-PA3、rBTTB-PA3與rVP1*C-PA3)。免疫印跡的分析結果顯示了它們均具有良好免疫反應性。
　　其次，制備3種FMDV細菌樣顆粒(BLP)載體疫苗并檢測其免疫效果。用GEM顆粒吸附與純化上述3種可溶性融合蛋白，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)3種可溶性融合蛋白不規(guī)則地分布在GEM顆粒周圍，濃度分別達到8

5、5μg/mL(rTB-PA3)、213μg/mL(rBTTB-PA3)和870μg/mL（rVP1*C-PA3）。將3種細菌樣顆粒分別與白油佐劑乳化制成BLP疫苗，并免疫5周齡ICR小鼠，分別于免疫后21、35、42、49、56和63d采集血清，檢測VP1蛋白特異性抗體水平與液相阻斷抗體水平。于免疫后第35天進行淋巴細胞轉化實驗及脾臟中IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α四種細胞因子mRNA表達水平檢測。結果顯示BLP/rBTT

6、B-PA3能夠有效刺激小鼠產生較高水平的VP1蛋白特異性抗體與液相阻斷抗體;BLP/rBTTB-PA3免疫組的淋巴細胞增殖水平極顯著高于其他BLP疫苗免疫組;BLP/rBTTB-PA3免疫組IFN-γ與IL-4的mRNA表達水平較其余2種BLP疫苗免疫組顯著上調，但與合成肽疫苗免疫組無顯著差異;所有實驗組IL-10和TNF的mRNA表達水平均無明顯差異。這些結果說明BLP/rBTTB-PA3疫苗的免疫原性最好，可誘導小鼠產生良好的體液免

7、疫應答及Th1型細胞免疫應答。
　　最后，檢測免疫增強劑CVC1302對BLP/rBTTB-PA3免疫效果的影響。在BLP/rBTTB-PA3疫苗中添加CVC1302免疫增強劑后免疫ICR小鼠和口蹄疫抗體陰性仔豬，檢測免疫血清中VP1蛋白特異性抗體水平和液相阻斷抗體水平以及外周血淋巴細胞增殖水平。結果顯示，BLP/rBTTB-PA3+CVC1302免疫組小鼠與仔豬血清中VP1蛋白特異性抗體水平和液相阻斷抗體水平均顯著高于BLP/r