RNA干擾及治療性DNA疫苗抗乙型肝炎病毒研究.pdf

1、病毒性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的一種嚴重危害人類健康的傳染病。目前通常采用干擾素、核苷類似物和其它免疫調(diào)節(jié)劑等進行乙型肝炎的治療。但由于乙肝病毒能以共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的形式存在于肝細胞核內(nèi),而抗病毒治療容易引起病毒的耐藥性突變及其他的副作用,因此亟需發(fā)展新的有效的治療藥物和方法。RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為病毒性乙型肝炎的有效治療提供了一條新的思路。RNA干擾(RNA in

2、terference)是一種由雙鏈RNA誘發(fā)降解同源mRNA的基因沉默(gene silencing)現(xiàn)象。該作用除了具有高度的特異性、高效性外,人們還可以針對病毒基因保守區(qū)域選擇多個靶點進行RNAi治療,以應對病毒變異產(chǎn)生逃避突變株,更重要的是RNAi在病毒非活躍復制期也能發(fā)揮作用?；赗NAi技術(shù)的眾多優(yōu)點,我們對應用RNAi進行抗乙肝病毒治療的效果進行了研究,從RNAi靶序列的選擇,siRNA的載體制備,它們在細胞模型和動物體內(nèi)的

3、抑制乙肝病毒基因表達的效果,及其劑量效應,時間效應和作用穩(wěn)定性等方面進行了考察,希望為發(fā)展RNAi抗乙肝病毒藥物提供參考。進一步地,我們還針對siRNA作為抗病毒藥物應用的一個瓶頸問題：siRNA的輸送和細胞轉(zhuǎn)染效率,進行了研究。對提高質(zhì)粒DNA的細胞轉(zhuǎn)染和肝靶向輸送進行了多種嘗試,獲得了有潛在應用價值的一些前期結(jié)果。雖然siRNA的體內(nèi)輸送和轉(zhuǎn)染依然是限制RNAi相關藥物研發(fā)的關鍵問題,希望我們的這些嘗試能為最終的解決方案提供一些思路

4、。最后,我們也對乙肝治療新方案中的另一條重要思路：乙肝治療性DNA疫苗的藥效進行了研究。我們實驗室在前期工作中,發(fā)展了DNA疫苗的電導入技術(shù),免疫健康小鼠和恒河猴模型后,產(chǎn)生了快速和強烈的體液和細胞免疫。在本論文工作中,我們進一步地驗證了產(chǎn)生的免疫應答對病毒蛋白的清除作用,我們分別使用模擬乙肝病毒感染的小鼠(尾靜脈高壓注射乙肝表面蛋白表達質(zhì)粒)和感染乙肝病毒的狒狒(baboon)作為動物模型,觀察電導入DNA疫苗后誘導的免疫應答情況及對

5、乙肝病毒的清除情況,為治療性疫苗的臨床研究提供了重要的支持。本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果總結(jié)如下：1.我們根據(jù)國內(nèi)乙肝病毒流行的情況和實驗模型確定了研究用乙肝病毒的亞型并通過測序確定了基因序列,根據(jù)RNAi干擾作用的特點在乙肝病毒復制轉(zhuǎn)錄和分泌過程中發(fā)揮重要作用的表面蛋白編碼區(qū)-S區(qū)選擇了三段序列作為RNAi作用靶點,經(jīng)BLAST驗證與其它基因無明顯同源性后針對這三個靶點用化學合成法制備了siRNA和化學修飾(其中對A,U堿基甲基化修飾)的s

6、iRNA,同時我們也設計了用于siRNA表達載體構(gòu)建的DNA插入片段,并將其克隆到帶人U6啟動子的shRNA質(zhì)粒表達載體上,經(jīng)酶切及測序驗證后大提純化以用于細胞及動物實驗。2.我們用細胞模型研究了siRNA對HBV抗原基因復制和表達的影響。我們首先將siRNA、甲基化修飾siRNA或shRNA表達質(zhì)粒與乙型肝炎病毒表面抗原真核表達質(zhì)粒(pHBS)共轉(zhuǎn)染HuH-7細胞,結(jié)果表明針對S區(qū)基因篩選和合成的siRNA都能在肝細胞中明顯降解靶基因

7、mRNA,減少表面抗原的形成(抑制率達到80-90%),同時它們的作用隨著劑量的增加而加強,針對三個靶點的siRNA同時使用也可以一定程度上增強對表面抗原合成的抑制作用。不過三種形態(tài)的siRNA的作用和動力學特征有所不同,其中siRNA作用較強但作用維持時間較短；甲基化修飾一定程度上影響了siRNA的干擾作用,但另一方面也增加了siRNA的穩(wěn)定性,延長了干擾作用的時間；而shRNA表達質(zhì)粒的作用與siRNA相似,但它的作用時間明顯比si

8、RNA和甲基化修飾的siRNA長。在利用HepG2.2.15細胞模型進行siRNA對乙肝病毒復制和轉(zhuǎn)錄影響的研究中,我們證實siRNA能夠明顯地降低細胞和培養(yǎng)液中的乙肝病毒DNA和表面抗原的水平,抑制率可以達到60%以上(不考慮已經(jīng)存在的病毒DNA和蛋白及細胞的轉(zhuǎn)染效率),而且我們發(fā)現(xiàn)siRNA在對HepG2.2.15細胞中對乙肝病毒的抑制具有劑量效應,甲基化修飾siRNA對病毒復制和轉(zhuǎn)錄的抑制作用雖然略低于siRNA,但能夠持續(xù)更長時

9、間。3.在證明siRNA可以在體外有效的干擾乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄和復制后,我們研究了不同結(jié)構(gòu)的siRNA在小鼠肝臟內(nèi)對乙肝表面抗原表達的抑制作用和特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與pHBS共轉(zhuǎn)染的不同形態(tài)的siRNA都能夠明顯降低表面抗原mRNA的水平并減少蛋白的生成,它們的作用同樣表現(xiàn)出劑量效應。siRNA的作用在三天以后明顯降低,甲基化修飾siRNA的作用能夠維持相對較長的時間,但在第五至七天也基本消失,而shRNA表達質(zhì)粒的作用是最穩(wěn)定的,在第十一天依然

10、能抑制50-60%的抗原表達,在注射后三十天還能檢測到它對乙肝蛋白形成的抑制。siRNA不僅能夠抑制與之共轉(zhuǎn)染的pHBS的轉(zhuǎn)錄,對預先在小鼠肝臟中存在并表達的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄也有抑制作用,不考慮已經(jīng)存在于肝細胞中的蛋白及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率,siRNA在第一天就可以抑制60%的蛋白生成,第二天達到80%左右,表面抗原在血液中滴度的降低更加明顯,到第二天已基本檢測不到抗原的存在。另外我們還發(fā)現(xiàn)siRNA可以使乙肝表面抗原的形成量降低到不足以在體內(nèi)誘導

11、相應抗體的產(chǎn)生。4.siRNA的體內(nèi)靶向輸送是其用于抗病毒治療的一個主要障礙,在體外實驗中我們發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體結(jié)合DNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15的效果不好,而在體內(nèi)尾靜脈注射后則基本看不到效果。為了提高脂質(zhì)體的細胞轉(zhuǎn)染效率及體內(nèi)輸送和轉(zhuǎn)染的效率,我們進行了一系列的嘗試。體外實驗發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體包裹密度較大的釓噴酸葡胺或碘海醇溶液可以明顯提高質(zhì)粒對細胞的轉(zhuǎn)染效率(5倍到25倍),但碘海醇脂質(zhì)體的細胞毒性明顯低于釓噴酸葡胺脂質(zhì)體。另外我們嘗試了使用

12、不同的物理化學輸送方法,包括Hydrodynamic注射,含氣脂質(zhì)體超聲輸送,肝臟介入,肝臟直接注射及電轉(zhuǎn)染和多室脂質(zhì)體載體等用于小鼠肝靶向DNA輸送,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用含氣脂質(zhì)體,多室脂質(zhì)體,肝臟介入,肝臟直接注射及電轉(zhuǎn)染等方法都可以一定程度的提高質(zhì)粒DNA的針對肝細胞的靶向輸送,但轉(zhuǎn)染效率的提高并不明顯。而Hydrodynamic注射可以非常高效率的將質(zhì)粒DNA特異的輸送到肝臟,但該方法無法用于臨床,因此還需要尋找其它高效的肝靶向si

13、RNA輸送方法。5.我們將乙肝表面抗原表達質(zhì)粒(pHBS)作為HBV-DNA疫苗研究了在電轉(zhuǎn)染作用下在小鼠體內(nèi)的免疫誘導情況并對模擬急性感染的乙肝病毒的清除能力。實驗結(jié)果表明給小鼠注射5μg的表面抗原表達質(zhì)粒并給予電脈沖刺激能夠明顯提高表面抗原誘導的體液免疫并使產(chǎn)生的抗體更快的達到保護水平,而且作為主要細胞免疫應答代表的IFN-γ的水平也明顯比對照組高。在小鼠產(chǎn)生抗體以后,經(jīng)尾靜脈高壓注射乙肝表面抗原表達質(zhì)粒模擬病毒感染,結(jié)果顯示經(jīng)質(zhì)粒

14、電轉(zhuǎn)染免疫的小鼠其肝內(nèi)的表面抗原的最高水平只有對照組的10%左右,而且在第三天就已經(jīng)檢測不到；血液中表面抗原的變化更加明顯,在注射抗原表達質(zhì)粒12小時后根本檢測不到表面抗原的存在,既便是在對照組抗原表達達到高峰的24小時,其血液依然為HBsAg陰性。免疫組化結(jié)果證明肝臟中表面抗原陽性細胞的數(shù)量及表面抗原的水平明顯低于對照組。HE染色發(fā)現(xiàn)肝組織沒有明顯的壞死和淋巴細胞浸潤,而且免疫組和對照組的ALT水平也沒有顯著性的差異,表明細胞免疫對抗