電脈沖介導(dǎo)的乙型肝炎DNA疫苗的研究.pdf

1、DNA疫苗因其能夠同時(shí)誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答和特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答而成為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ囊呙缃臃N技術(shù)。應(yīng)用質(zhì)粒DNA作為疫苗的成功關(guān)鍵在于選擇高效的疫苗接種技術(shù)。電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗導(dǎo)入技術(shù)不僅可以同時(shí)輸送多種基因，而且能夠極大地提高基因轉(zhuǎn)染的效率，有效地激發(fā)免疫應(yīng)答。 為了深入研究電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗導(dǎo)入技術(shù)，我們?cè)O(shè)計(jì)并制造了增強(qiáng)基因輸送效率的電脈沖發(fā)生器及針式電極導(dǎo)入裝置，應(yīng)用可定量的報(bào)道基因檢測(cè)系統(tǒng)，變化儀器的各種參數(shù)

2、，摸索了電脈沖介導(dǎo)的基因輸送技術(shù)的優(yōu)化條件。在此基礎(chǔ)上，使用針對(duì)乙型肝炎的DNA疫苗(該疫苗包括一種編碼乙肝病毒表面抗原(HBsAg)上preS2-S蛋白的質(zhì)粒和一種表達(dá)白介素-2(IL-2)和干擾素-γ(IFN-γ)的融合蛋白)，研究了HBVDNA疫苗在電脈沖介導(dǎo)的基因輸送技術(shù)的作用下在多種動(dòng)物模型中的免疫效果，為臨床實(shí)驗(yàn)和研究提供了良好的基礎(chǔ)和依據(jù)。 本論文的主要結(jié)果總結(jié)如下： 1)設(shè)計(jì)并搭建了一系列電脈沖介導(dǎo)的基因

3、輸送實(shí)驗(yàn)儀器和電極針。應(yīng)用模塊化設(shè)計(jì)方法，計(jì)算并選擇恰當(dāng)?shù)碾娮訁?shù)，使用先進(jìn)的弱電對(duì)強(qiáng)電的控制技術(shù)，設(shè)計(jì)并制造了可大范圍靈活調(diào)節(jié)各種電學(xué)物理參數(shù)的電脈沖發(fā)生器和具有不同針式電極陣列的導(dǎo)入裝置。該系列儀器的電場(chǎng)強(qiáng)度可調(diào)范圍為0-1200V/cm，單個(gè)脈沖可調(diào)范圍為10μs-100ms，脈沖個(gè)數(shù)可達(dá)999個(gè)；并且能夠產(chǎn)生多種變換電場(chǎng)極性和高低壓組合的波形序列。 2)利用自主開發(fā)的電脈沖實(shí)驗(yàn)裝置，應(yīng)用熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)行大量

4、的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，變化各種電學(xué)參數(shù)，研究其對(duì)基因轉(zhuǎn)染率的影響，從而摸索出能夠在最大程度上提高基因轉(zhuǎn)染率的合適的物理?xiàng)l件。具體來說，最佳的電場(chǎng)強(qiáng)度范圍是100-300V/cm；最佳脈沖個(gè)數(shù)是6個(gè)脈沖；最佳單個(gè)脈沖時(shí)間為50-100ms。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，電場(chǎng)極性變換的脈沖波形和高低壓組合的脈沖波形并沒有更明顯地增加轉(zhuǎn)染效率。 3)探討了一些生化條件對(duì)電脈沖介導(dǎo)的基因輸送效率的影響。驗(yàn)證了短片斷DNA和Poly-L-Glutamate能夠提高在體

5、電脈沖介導(dǎo)的基因輸送技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶液中存在的Ca2+能夠大大地抑制電脈沖技術(shù)輸送的外源基因的表達(dá)量，使其降至對(duì)照組的5﹪，實(shí)驗(yàn)表明，這種抑制效應(yīng)是鈣離子所特有的，并且沒有組織特異性。 4)對(duì)小鼠和恒河猴進(jìn)行了電脈沖介導(dǎo)的HBVDNA疫苗免疫效果的研究。研究結(jié)果表明，對(duì)小鼠來說，一次電轉(zhuǎn)染5μg的DNA疫苗，無需進(jìn)行免疫增強(qiáng)就能夠誘導(dǎo)持續(xù)達(dá)4個(gè)月以上的高滴度體液免疫應(yīng)答和顯著的細(xì)胞免疫應(yīng)答。首次應(yīng)用靈長(zhǎng)類動(dòng)物恒河猴進(jìn)

6、行了電介導(dǎo)的HBVDNA疫苗實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，電脈沖接種0.5mg的DNA疫苗并增強(qiáng)一次后，部分恒河猴個(gè)體出現(xiàn)高于保護(hù)劑量(10mIU/m1)的抗體應(yīng)答；隨著免疫次數(shù)的增加，產(chǎn)生抗體的個(gè)體數(shù)持續(xù)增加；經(jīng)過三次免疫后，12只接受電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗注射的動(dòng)物中有10只產(chǎn)生高于保護(hù)劑量的抗體滴度；并且，高滴度抗體的持續(xù)時(shí)間也隨免疫次數(shù)的增加而增長(zhǎng)。應(yīng)用ELISpot檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，這些動(dòng)物體內(nèi)也誘導(dǎo)了有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 之后，使