重組CS1聯(lián)合HBsAg治療性乙型肝炎疫苗的研究.pdf

1、慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全球性疾病，目前尚無(wú)有效的藥物進(jìn)行治療，疫苗仍然是預(yù)防乙肝的重要手段。目前普遍使用的乙型肝炎疫苗是以乙肝表面抗原蛋白為基礎(chǔ)的，此類(lèi)疫苗可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，從而起到預(yù)防乙型肝炎的作用。但此類(lèi)疫苗最大的缺點(diǎn)是不能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫，而細(xì)胞免疫在清除細(xì)胞內(nèi)病毒，以及打破慢性乙肝患者持續(xù)的免疫耐受狀態(tài)具有極其重要的作用。 本研究對(duì)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所構(gòu)建的HBV(中國(guó)流行株)核心抗原

2、與PreS1融合重組質(zhì)粒(CS1)進(jìn)行了轉(zhuǎn)導(dǎo)、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳、western檢測(cè)和抗原性鑒定，確定該蛋白理化、生物學(xué)特性與理論結(jié)果一致。對(duì)表達(dá)的HBV融合蛋白CS1使用DEAE-Sepharose4FF離子交換和Sephadex-G75分子篩進(jìn)行了兩步層析純化得到了純度達(dá)到98％以上，抗原性較好，免疫原性較強(qiáng)的蛋白。 將純化后的HBV融合蛋白CS1與蘭州生物制品研

3、究所疫苗三室生產(chǎn)的CHO-乙型肝炎表面抗原(HBsAg)聯(lián)合，以不同劑量免疫BALB/C小鼠，并用兩疫苗單獨(dú)免疫作為參照，以生理鹽水作為對(duì)照。免疫后于不同時(shí)間采血ELISA方法檢測(cè)小鼠血清抗體；制備脾臟單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，做MTT檢測(cè)；用血清抗體效價(jià)和淋巴細(xì)胞增殖情況兩種標(biāo)準(zhǔn)確定最優(yōu)劑量和最佳免疫程序。用合適劑量的HBcAg與HBsAg聯(lián)合(CS1+S)后，以終濃度為1mg/mlAl(OH)3作為佐劑與不含佐劑的CS1+S抗原組同時(shí)免

4、疫BALB/C小鼠，并用兩種疫苗單獨(dú)免疫(含和不含Al(0H)3)作為參照，以生理鹽水作為對(duì)照。免疫后用ELISA方法測(cè)定抗體產(chǎn)生的滴度；制備脾臟單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平；應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞亞群；最后應(yīng)用DTH試驗(yàn)檢測(cè)抗原引起的BALB/C小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)。最后的結(jié)果顯示HBcAg與HBsAg聯(lián)合免疫小鼠產(chǎn)生的IFN-γ量與二者單獨(dú)免疫相比有顯著性差異(P＜0.05)，CD3+CD4+水平

5、與后者相比顯著增高(P＜0.05)；含Al(OH)3佐劑的聯(lián)合疫苗CD8+水平比空白對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)；聯(lián)合疫苗產(chǎn)生的保護(hù)性抗體anti-HBs與2倍劑量的HBsAg單獨(dú)免疫相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；含Al(OH)3佐劑與不含佐劑的抗原免疫效果差異不顯著(P＞0.05)。 總之，本課題工作表明，用CS1與HBsAg聯(lián)合，具有良好的體液免疫與細(xì)胞免疫效果，有助于清除HBV病毒并有希望打破HBV感染引起的慢性