慢性乙型肝炎患者低血清HBsAg水平發(fā)生機(jī)制的研究.pdf

1、目的：慢性乙型肝炎患者外周血中含有大量乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus,HBV)的表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg),每毫升血清中HBsAg的水平通常在數(shù)千至數(shù)萬(wàn)國(guó)際單位。但在臨床上也可發(fā)現(xiàn),少部分慢性HBV感染者的血清HBsAg水平較低,即使存在HBV的復(fù)制(HBV DNA≥104拷貝/ml),其HBsAg水平仍低于250 IU/ml。本文主要探討慢性HBV感染者低血清HBsA

2、g水平的發(fā)生機(jī)制。
　　 材料與方法：HBV標(biāo)志物的檢測(cè)采用雅培公司試劑,在雅培公司ARCHITECT i2000SR儀器上進(jìn)行。HBV DNA檢測(cè)采用達(dá)安公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。通過(guò)分析1783例慢性HBV感染者血清標(biāo)本HBV標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果,收集HBsAg水平低于250 IU/ml的血清標(biāo)本與生化學(xué)、HBV DNA及臨床資料。采用酚/氯仿方法抽提血清中的HBV DNA,并對(duì)HBV S基因區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。對(duì)其中4

3、例出現(xiàn)S基因變異的血清標(biāo)本,進(jìn)行全基因擴(kuò)增并測(cè)序,從而得到血清HBV全基因序列。
　　 將4例標(biāo)本的全基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆及測(cè)序,與血清中HBV全基因序列進(jìn)行比較,挑選出代表優(yōu)勢(shì)株的克隆。將HBV優(yōu)勢(shì)株的小S蛋白基因克隆至pXF3H真核表達(dá)載體,在小S蛋白的氨基端加入HA標(biāo)簽蛋白。將該表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染Huh7及Hela細(xì)胞,用ARCHITECT HBsAg QT方法檢測(cè)上清液HBsAg的水平。用針對(duì)HA的抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),檢

4、測(cè)細(xì)胞內(nèi)及上清液中含HA標(biāo)簽蛋白的HBsAg表達(dá)量。
　　 結(jié)果：在1783份標(biāo)本中,HBsAg水平低于250 IU/ml且HBV DNA大于1×104拷貝/ml的患者35例。故HBsAg水平低于250 IU/ml且HBV DNA大于1×104拷貝/ml發(fā)生率為1.87％。通過(guò)分析16例HBsAg水平患者的HBV S基因區(qū)氨基酸序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有15例患者的HBV S基因氨基酸序列發(fā)生了變異,其中報(bào)道較多的位點(diǎn)包括:sT120T

5、,sT/I126N,sQ129/N,sG130/R,sT131N,sM133T。少有報(bào)道的位點(diǎn)為:sN40S,sI68T,sC76Y,sL95W,sV96G,sL98V,sS117T,sA157D,sW196L,sF220L。發(fā)現(xiàn)S13患者S區(qū)的啟動(dòng)子(nt2976-3174)缺失,在15個(gè)克隆中,有13個(gè)克隆存在此區(qū)域的缺失。S15患者HBV S基因的第220位核苷酸堿基由T變?yōu)锳,使S基因22位密碼子由亮氨酸(UUA)變?yōu)榻K止密碼子

6、(UAG)。對(duì)4例患者的HBV的全基因進(jìn)行了擴(kuò)增,成功克隆了HBV全基因。
　　 將S11(含有sQ129/N變異位點(diǎn))和S14(含有sT/I126N及sT131N變異位點(diǎn))的優(yōu)勢(shì)株小S基因克隆至pXF3H質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)上清中HBsAg水平較野毒株水平低2-4倍,但用針對(duì)HA抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這兩例患者HBV優(yōu)勢(shì)株的HBsAg的表達(dá)量較野毒株明顯增加,糖基化HBsAg的比例明顯增多,而細(xì)胞裂解液中HBsAg表達(dá)量

7、也顯著增加。用針對(duì)小S蛋白多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解液中HBsAg不能被檢測(cè)出來(lái)。
　　 結(jié)論：大多數(shù)慢性HBV感染者(90％以上)的血清HBsAg水平在250 IU/ml以上。在HBV DNA大于1×104拷貝/ml慢性HBV感染者中,低于250 IU/ml的患者占1.87％。HBV S基因區(qū)某些氨基酸的變異是造成低HBsAg水平的主要因素。S基因區(qū)氨基酸變異引起低HBsAg水平的機(jī)制主要是S基因區(qū)某些氨基酸變異