抗乙型肝炎病毒的小干擾RNA靶位點篩選平臺的建立.pdf

1、第一部分抗乙型肝炎病毒S基因的小干擾RNA靶位點篩選體系的建立 目的:針對乙型肝炎病毒S基因(HepatitisBvirussgene，HBs)序列制備兩種小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，載體法構(gòu)建3個小發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)表達載體和化學(xué)合成法制備一個siRNA分子，同時構(gòu)建增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和HBs基因融合表達載體，共轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細胞，在

2、mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測兩種siRNA對HBs基因表達的抑制作用，篩選出最有效抑制HBs的siRNA作用靶位點。 方法:抽提HepG2.2.15細胞基因組，用PCR法獲取HBs基因片段，克隆在增強型綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-N3上，構(gòu)建成pHBs-EGFP融合蛋白表達載體；利用psiRNA-hHlneo質(zhì)粒，構(gòu)建針對HBs基因的shRNA表達載體psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3；化學(xué)合成小干擾RNAsiR

3、NA-HBs，共轉(zhuǎn)染Hela細胞，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量PCR儀檢測siRNA對HBs基因mRNA表達的抑制作用，用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測shRNA對融合蛋白表達的抑制作用。 結(jié)果:成功構(gòu)建shRNA表達載體和pHBs-EGFP表達載體，shRNA表達載體和化學(xué)合成的siRNA均可不同程度地抑制HBs基因的表達，其中載體psiRNA1對HBs基因的抑制作用最強，對HBsmRNA抑制率達78.77％，對融合蛋白HBs-

4、EGFP的抑制率為61.94％；化學(xué)合成的siRNA在50nM時抑制作用最大，對HBsmRNA抑制率達61.30％，對融合蛋白HBs-EGFP的抑制率為48.73％。 結(jié)論:篩選出抑制HBs基因作用最強的的siRNA靶位點，位于ayw亞型HBV基因組161nt～181nt，成功地建立了一個行之有效、相對經(jīng)濟簡便且便于長期研究的RNA干擾研究體系，為以后的抗HBV治療和RNA干擾相關(guān)技術(shù)的實驗研究打下基礎(chǔ)。 第二

5、部分抗乙型肝炎病毒X基因的小干擾RNA靶位點篩選體系的建立 目的:針對乙型肝炎病毒X基因(HepatitisBvirusXgene，HBx)序列制備兩種siRNA，載體法構(gòu)建3個shRNA表達載體和化學(xué)合成法制備一個siRNA分子，同時構(gòu)建HBx表達載體pHBx，共轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細胞，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測兩種siRNA對X基因表達的抑制作用，篩選出最有效抑制該基因的靶位點。 方法:抽提HepG2.2.15細

6、胞基因組，用PCR法獲取HBx基因片段，克隆在真核表達載體pCDNA3上，構(gòu)建成pHBx表達載體；利用psiRNA-hH1neo質(zhì)粒，構(gòu)建針對HBx基因的shRNA表達載體psiRNA4、psiRNA5、psiRNA6，化學(xué)合成小干擾RNAsiRNA-HBx，共轉(zhuǎn)染Hela細胞，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量PCR儀檢測siRNA對HBx基因mRNA表達的抑制作用，用免疫印跡法(WesternBlot)檢測siRNA對HBx蛋白表達的抑

7、制作用。結(jié)果成功構(gòu)建shRNA表達載體和pHBx表達載體，shRNA表達載體和化學(xué)合成的siRNA均可不同程度地抑制HBx基因的表達，其中shRNA載體psiRNA4對HBx基因的抑制作用最強，對HBxmRNA抑制率達80.27％，對HBx蛋白的抑制率為65.59％；化學(xué)合成的siRNA在50nM時抑制作用最大，對HBxmRNA抑制率達56.38％，對HBx蛋白的抑制率為56.53％。 結(jié)論:篩選出抑制作用最強的HBx基因的si

8、RNA靶位點，位于ayw亞型HBV基因組1764nt～1784nt，載體法和化學(xué)合成法siRNA都能有效封閉HBx基因的表達，這對控制HBV感染和預(yù)防HBV相關(guān)性肝細胞癌的發(fā)生都有十分重大的意義。 第三部分shRNA在HepG2.2.15細胞內(nèi)的抗HBV活性 目的：RNAi技術(shù)可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著抑制HBs基因和HBx基因的表達，如果在HBV整體的復(fù)制水平上也能夠起到明顯的抑制作用，則該技術(shù)在治療HBV感染

9、和防治HBV相關(guān)性肝細胞癌方面將有更廣闊的應(yīng)用的前景。 方法：HepG2.2.15細胞系是由頭尾相接的HBVayw亞型基因組轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2而建立的一株能穩(wěn)定分泌HBV各種抗原和完整病毒顆粒的細胞系。因而用HepG2.2.15細胞進行RNA干擾的抗病毒研究更接近于疾病的治療過程。因此，把上述兩部份篩選的載體法siRNApsiRNA1和psiRNA4分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，用實時熒光定量PCR測定培養(yǎng)上清中HBV

10、DNA水平的變化，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的變化。 結(jié)果：初步結(jié)果表明，通過內(nèi)源性傳遞產(chǎn)生的siRNA能夠明顯地抑制HepG2.2.15細胞HBV的復(fù)制。psiRNA1能抑制HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清68％的HBsAg和25.4％的HBeAg，對培養(yǎng)上清中HBVDNA的抑制率達52.7％。而psiRNA4能抑制HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清79％的HBsAg和88.7％的HBeA