逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)的建立及其在抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因表達(dá)中的應(yīng)用.pdf

1、陟7l『大并陟7lI犬罄博士學(xué)位論文題目遒撞丞疸壹僉昱酸墅墜王拯撞苤的建寞厘甚查翅劍圣型躚煎痘壹!玨壁y2基固麥姿生鰒麈眉作者囂越。完成日期壘QQ垂生墨目目培養(yǎng)單位指導(dǎo)教師專四川太堂生金科堂堂院主墾登堂睦邀生塹盈巍匿韭望垂一煎援旦遮硒究雖璺型盔堂堡主堂壁壘塞炎病毒(HBv)的抗體藥物、基因療法等新的特異性療法是抗HBV的研究熱點(diǎn)。特別RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和RNAi技術(shù)的逐漸成熟，使這些一直難以解決的病毒性疾病的治療與預(yù)防出現(xiàn)轉(zhuǎn)機(jī)，對(duì)肝炎的

2、R1q越研究正方興未艾但近幾年有關(guān)乙肝的研究中所用的化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄合成、質(zhì)粒載體介導(dǎo)表達(dá)的siRNA，都要借助于物理方法和細(xì)胞轉(zhuǎn)染手段才能將其導(dǎo)入細(xì)胞，限制了其干擾效率和在活體中的應(yīng)用，因此尋找更加穩(wěn)定可靠的干擾方法勢(shì)在必行。本研究建立了一種逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)siRNA的RNA干擾技術(shù)。首先構(gòu)建出靶向p53基因的H1sip53的表達(dá)盒，將其分別克隆到病毒載體pXSN和pXRN中，構(gòu)建融合逆轉(zhuǎn)錄病毒分子，在GP293細(xì)

3、胞中包裝成病毒顆粒后感染HepG2細(xì)胞，并挑取G418抗性的單克隆細(xì)胞。Western印跡檢測結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞相比，整合了H1sip53的HepG2單克隆細(xì)胞中，D53基因的表達(dá)被特異性抑制，并且這種抑制可以持續(xù)至少2個(gè)月。結(jié)果還顯示，融合載體pXSN比pXRaN更加有效和穩(wěn)定。用pBabepuro構(gòu)建的融合病毒對(duì)以上單克隆細(xì)胞進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)染，用luro抗生素再次篩選細(xì)胞，結(jié)果表明，2次轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的p53基因表達(dá)抑制更加強(qiáng)烈，說

4、明此RNAi系統(tǒng)的抑制效率是siRNA拷貝數(shù)依賴性的。本實(shí)驗(yàn)還通過realtimePCR證明，用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)19nt的siRNA并不會(huì)激活抗病毒的干擾素途徑。以上結(jié)果表明，本研究所建立的高效特異的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RIgA干擾技術(shù)，可以將siRNA表達(dá)盒穩(wěn)定整合到細(xì)胞的基因組中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向基因表達(dá)的長期穩(wěn)定抑制。為研究上述RNAi方法對(duì)HBV的作用效率，我們選擇了靶向HBsAg區(qū)的2個(gè)siHBV，利用上述建立的RNA

5、干擾技術(shù)，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的可以在HepG2和HepG2215細(xì)胞中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)siHBVl和siHBV2的RNAi系統(tǒng)。首先構(gòu)建U6一siHBV表達(dá)盒，并將此表達(dá)盒分別克隆到病毒載體pXSN、pXRN和pBabepuro中，構(gòu)建融合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在GP293細(xì)胞中包裝成融合逆轉(zhuǎn)錄病毒。用融合病毒pXSNU6siHBV和pXRNU6siHBV分別感染HepG2細(xì)胞，篩選G418抗性細(xì)胞。用可以表達(dá)HBV相關(guān)蛋白的TopoHBV載體轉(zhuǎn)