逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的反義端粒酶RNA基因誘導(dǎo)肝癌凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘?xì)胞株Bel—7402凋亡相關(guān)分子的影響。從凋亡相關(guān)基因的角度研究反義端粒酶基因誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株凋亡的作用機(jī)制。觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘?xì)胞株作用的長期效應(yīng)。 方法：本課題組前期研究成功利用用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXSN構(gòu)建攜帶正義和反義端粒酶RNA基因真核表達(dá)載體，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增、提取，電穿孔法將攜帶正義和反義端粒酶RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入PT

2、67包裝細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)病毒細(xì)胞株，分別命名為PT67—hTR—EcoRI和PT67—hTR—BamHI；收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，超速離心獲得濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用NIH3T3細(xì)胞檢測(cè)所收集逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度；感染肝癌細(xì)胞株BEL—7402，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細(xì)胞克隆，分別命名為BEL—7402—hTR—EcoRI和Bel—7402—hTR—BamHI；挑取單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，利用擴(kuò)增端粒酶RNA基因的引物進(jìn)行PCR鑒定；TR

3、AP—PCR—ELISA法檢測(cè)端粒酶活性，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期，Hochest33258標(biāo)記熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡，Annexin V—PI（碘化丙錠）雙染FCM分析細(xì)胞凋亡。Western Blot檢測(cè)P53、Bax、Bcl—2蛋白表達(dá)水平變化，以β—actin作為內(nèi)參照。 結(jié)果：PCR鑒定可于約500bp處檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，證明基因轉(zhuǎn)染成功；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果示試驗(yàn)組Bel—7402—hTR—Ba

4、mHI細(xì)胞的凋亡率為（19．0±2．06）％，與對(duì)照組相比差別具有顯著性（P<0．01），且試驗(yàn)組肝癌細(xì)胞可見G2/M期阻滯及凋亡峰。Hochest33258染色顯示Bel—7402—hTR—BamHI細(xì)胞凋亡增加。Western Blot檢測(cè)到P53、Bcl—2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bax表達(dá)水平下調(diào)。 結(jié)論：端粒酶RNA（hTR）是端粒酶活性的一個(gè)重要組成部分，本研究數(shù)據(jù)顯示通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的反義端粒酶RNA基因能夠抑制肝癌細(xì)