逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的端粒酶抑制基因?qū)σ认侔┰鲋车蛲龅淖饔?pdf

1、目的：運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，將端粒酶抑制基因?qū)胍认侔┘?xì)胞Can-pan-2，研究其對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，為胰腺癌的基因治療提供新途徑。 方法：用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pLXSN-bTR，以期重組質(zhì)粒表達(dá)反義端粒酶RNA，通過電穿孔法將攜帶正反義端粒酶RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入PT67包裝細(xì)胞，G418篩選抗性細(xì)胞，獲取穩(wěn)定表達(dá)病毒的產(chǎn)病毒細(xì)胞株，收集細(xì)胞上清液，濃縮得到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，用NIH

2、3T3細(xì)胞測(cè)定病毒滴度，以濃縮后的病毒上清感染Can-pan-2細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆并擴(kuò)增培養(yǎng)，PCR檢測(cè)目的基因的插入，端粒酶反義RNA組分整合入胰腺癌細(xì)胞基因組中，通過其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞端粒酶活性，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性，免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：兩種逆

3、轉(zhuǎn)錄病毒上清的滴度分別為0.95×10<'6> CFU/ml和1.1×10<'6> CFU/ml，反義端粒酶RNA基因轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞Can-pan-2，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功，TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性，Can-pan-2-hTR-BamHI細(xì)胞端粒酶活性為0.67±0.07，較Can-pan-2-hTR-EcoRI(1.00±0.17)和Can-pan-2(1.1-4±0.27)明顯降低；免疫熒光化學(xué)法示Can-pan-

4、2及Can-pan-2-hTR-EcoRI細(xì)胞的PCNA平均熒光灰度值分別為26.92±0.57和26.20±0.77，顯著高于Can-pan-2-hTR-BamHI細(xì)胞的18.37±0.91；流式細(xì)胞儀示can-pan-2-hTR-BamHI細(xì)胞凋亡率為9.7﹪，顯著高于Can-pan-2(7.2﹪)及Can-pan-2-hTR-EcoRI細(xì)胞(6.9﹪)。 結(jié)論：端粒酶反義RNA組分經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞，可整合入胰