重組人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及檢測端粒長度新方法初探.pdf

1、第一章人端粒酶催化亞基(hTERT)的研究現(xiàn)狀和研究進(jìn)展（文獻(xiàn)綜述）
　　人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因是端粒酶的催化亞基，負(fù)責(zé)在染色體末端添加端粒重復(fù)序列，在維持細(xì)胞永生化中起重要作用。為探索過表達(dá)外源性hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生物學(xué)作用，本研究以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(hUVEC)為研究對(duì)象，通過真核轉(zhuǎn)染及病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)促進(jìn)hTERT基

2、因在hUVEC細(xì)胞中過表達(dá)，觀察其對(duì)hUVEC細(xì)胞增殖作用和端粒酶活性的影響?，F(xiàn)綜合近年來的文獻(xiàn)，對(duì)人端粒酶催化亞基的研究現(xiàn)狀作一簡要綜述。
　　第二章過表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖
　　目的:構(gòu)建含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(hUVEC)，探索轉(zhuǎn)染后hTERT基因的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞功能和生長的影響。
　　方法:攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的重組

3、質(zhì)粒（pEGFP-C1-hTERT）是利用已有的PCI-neo-hTERT和pEGFP-C1質(zhì)粒，通過酶切連接后，DNA測序驗(yàn)證了重組質(zhì)粒pEGFP-C1-hTERT的準(zhǔn)確性。將pEGFP-C1-hTERT真核表達(dá)載體通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到hUVEC中，通過RT-PCR、免疫組化、PCR-ELISA法和MTT檢測細(xì)胞端粒酶基因表達(dá)和活性變化與細(xì)胞生長增殖情況。
　　結(jié)果:所構(gòu)建pEGFP-C1-hTERT真核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)正確并能

4、夠在真核細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可見報(bào)告基因GFP的表達(dá);MTT實(shí)驗(yàn)可見轉(zhuǎn)染hTERT基因組72 h后細(xì)胞增殖速度快于未轉(zhuǎn)染組及空載體組;RT-PCR、免疫組化及TRAP-PCR-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTERT mRNA的表達(dá)、端粒酶活性均明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了pEGFP-C1-hTERT真核表達(dá)載體并能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)，過表達(dá)的hTERT基因提高了血管內(nèi)皮細(xì)胞端粒酶的活性和增殖能力，初步證實(shí)端粒

5、酶活性與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)，為進(jìn)一步構(gòu)建永生化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。
　　第三章構(gòu)建攜帶重組人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶第三代慢病毒載體及其病毒包裝鑒定
　　目的:構(gòu)建攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的慢病毒表達(dá)載體及探索高滴度第三代慢病毒包裝體系的建立，并觀察hTERT基因調(diào)控表達(dá)。
　　方法:用內(nèi)切酶將hTERT基因從已有質(zhì)粒PCI-neo-hTERT上切下，插入慢病毒載體pCDH-copGFP中構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-

6、hTERT，通過雙酶切鑒定、DNA測序分析驗(yàn)證人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)片段的準(zhǔn)確性后，將pCDH-hTERT、pCDH-PACK-GAG、pCDH-PACK-REV和VSV-G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，濃縮上清并測定病毒滴度獲得重組慢病毒，并進(jìn)行PCR及293T中hTERT蛋白的表達(dá)鑒定重組慢病毒的包裝。重組慢病毒再感染靶細(xì)胞hUVEC，通過檢測標(biāo)記蛋白-綠色熒光蛋白、hTERT蛋白表達(dá)和端粒酶活性進(jìn)一步驗(yàn)證pCDH-hTERT

7、在細(xì)胞中表達(dá)。
　　結(jié)果:pCDH-hTERT攜帶正確hTERT基因，將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞能產(chǎn)生重組病毒;病毒基因組PCR證實(shí)hTERT基因插入，感染后293T可檢測到hTERT蛋白的表達(dá);目的基因hTERT能被重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)，熒光顯微鏡下可直接觀察GFP; RT-PCR法、Western blotting法及TRAP-PCR-ELISA法能檢測感染后的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTERT mRNA的表達(dá)、

8、hTERT蛋白的表達(dá)及端粒酶活性明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了第三代慢病毒表達(dá)載體pCDH-hTERT，并獲得高效的重組慢病毒，將外源hTERT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞重建端粒酶活性，為構(gòu)建永生化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。
　　第四章廣西長壽物種端粒長度的檢測與納米金標(biāo)記的巰基寡聚核苷酸探針快速靈敏檢測端粒長度新方法的初探
　　目的:應(yīng)用Southern雜交技術(shù)對(duì)不同年齡段不同長壽物種端粒長度進(jìn)行檢測，從而了解Southern雜

9、交對(duì)端粒長度檢測的利弊，評(píng)估其是否適用于其他長壽物種的檢測，探討建立檢測針對(duì)不同物種端粒長度新方法的必要性，并初步探索利用納米金技術(shù)建立快速靈敏檢測端粒長度新方法可行性。
　　方法:選擇廣西常見的長壽物種草龜、眼鏡蛇作為研究對(duì)象，應(yīng)用Southern雜交技術(shù)進(jìn)行檢測不同年齡段不同長壽物種端粒長度，對(duì)檢測端粒長度進(jìn)行比較研究。以已知三種不同長度的端粒重復(fù)片段為標(biāo)準(zhǔn)品，初步探索將納米金的共振散射效應(yīng)和納米金標(biāo)記核酸探針結(jié)合起來建立一種

10、測定端粒長度的新方法。通過制備粒徑約10納米的金納米顆粒，用于標(biāo)記針對(duì)人端粒重復(fù)序列的共振散射光譜探針5'-(CCCTAA)5(CH2)3SH-3'，對(duì)標(biāo)記納米金生物探針上寡核苷酸連接及與樣品端粒雜交反應(yīng)體系條件進(jìn)行優(yōu)化，探索利用納米金技術(shù)建立快速靈敏檢測端粒長度新方法的可行性。
　　結(jié)果:所應(yīng)用Southern雜交技術(shù)進(jìn)行檢測不同年齡段不同長壽物種端粒長度特異性及靈敏性均不高，各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并成功完成標(biāo)記納米金生物探

11、針上寡核苷酸的連接，通過優(yōu)化了雜交反應(yīng)體系中緩沖溶液的pH、AussDNA濃度、NaCl濃度、超聲波輻照時(shí)間等四個(gè)主要反應(yīng)條件的影響，雜交后信號(hào)波動(dòng)較大，但仍未找到適合的雜交的反應(yīng)條件，尚未能建立起穩(wěn)定的納米金探針檢測端粒長度的新方法。
　　結(jié)論:Southern雜交技術(shù)采用針對(duì)人端粒重復(fù)片段特定探針，不適合應(yīng)用丁其他長壽物種的檢測，故需建立快速靈敏檢測針對(duì)不同物種端粒長度新方法。新方法中標(biāo)記好納米金生物探針與樣品端粒雜交反應(yīng)體系