共表達(dá)EGFP與布魯氏菌P39基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：本研究主要目的是構(gòu)建表達(dá)羊型布魯氏菌M5株P(guān)39基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為研發(fā)新型布魯氏菌DNA疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：1．目的基因的獲取：對主要在我國流行以及對人致病性最高的羊型布魯氏菌M5株擴(kuò)增培養(yǎng)，并提取全基因組。根據(jù)Genbank中已公布的基因組序列選擇已知的免疫原性高、主要誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答(cell-mediated immunity，CMI)的蛋白編碼基因(P39基因)，設(shè)計(jì)特異性引物利用PCR擴(kuò)增目的基因

2、片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，將P39基因與克隆載體pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)E．coli DH5α，經(jīng)藍(lán)白篩選得到連接正確的重組質(zhì)粒，將其命名為pMD19-T-P39質(zhì)粒，并應(yīng)用酶切、PCR以及基因測序等方法對其進(jìn)行鑒定。2．共表達(dá)P39和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建：對上述得到的重組質(zhì)粒pMD19-T-P39進(jìn)行酶切后，將目的基因P39插入到攜帶EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRev-IRES2-

3、EGFP載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)中。構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定后，采用脂質(zhì)體(Lipofectin)介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞(PT67)，經(jīng)G418篩選后將得到的陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。用收獲的培養(yǎng)上清液感染鑒定細(xì)胞(NIH-3T3)測定每毫升病毒液中感染性病毒顆粒的數(shù)量。此時，包裝細(xì)胞產(chǎn)生的假病毒即可作為攜帶羊型布魯氏菌特異性抗原基因P39的DNA疫苗。 結(jié)果：通過PCR方法成功地獲得了目的基因P39，并將其構(gòu)建到克隆