人Tim-3啟動(dòng)子的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、Tim-3(T-cell immunoglobulin-and mucin-domain-con"taming molecule-3,T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3)是新近發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)分子，特異表達(dá)于分化的Th1細(xì)胞，參與Th1負(fù)調(diào)控和免疫耐受形成，在多種免疫性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，阻斷其表達(dá)可緩解Th2應(yīng)答引起的過敏性疾病，是多種免疫性疾病的潛在治療靶標(biāo)，引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。但Tim-3研究尚存在諸多問題未能解決，尤其是其表達(dá)

2、調(diào)控機(jī)制研究尚屬空白。本研究分三部分內(nèi)容：初步研究正常人PBMC Tim-3的表達(dá)模式；克隆具有特異啟動(dòng)子活性的基因片段，構(gòu)建人Tim-3啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒；構(gòu)建Tim-3逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Tim-3表達(dá)調(diào)控機(jī)制及探索利用Tim-3進(jìn)行疾病治療的可行性奠定基礎(chǔ)。 第一部分正常人PBMC Tim-3表達(dá)模式的初步研究研究 目的：檢測經(jīng)絲裂原刺激的人外周血淋巴細(xì)胞Tim-3的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究Tim-3表達(dá)調(diào)控

3、機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?研究方法： 分離人PBMC，貼壁法去除單核細(xì)胞后，分別以PHA、LPS刺激懸浮的淋巴細(xì)胞，24h后抽提細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測Tim-3的表達(dá)。未刺激淋巴細(xì)胞作對照。 研究結(jié)果： RT-PCR檢測顯示PHA刺激的人外周血淋巴細(xì)胞Tim-3表達(dá)上調(diào)，而LPS刺激的不表達(dá)Tim-3，提示處于活化、非極化的T細(xì)胞就開始表達(dá)該分子。 結(jié)論：及意義： 本部分建立了可供作為研

4、究Tim-3表達(dá)調(diào)控的細(xì)胞模型，為進(jìn)一步深入研究Tim-3表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分人Tim-3啟動(dòng)子的克隆及其活性的初步研究研究 目的：構(gòu)建人Tim-3啟動(dòng)子螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒并分析其活性，為進(jìn)一步研究iTim-3特異表達(dá)于Thl細(xì)胞的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1人Tim-3啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測利用在線Matlnspector軟件對人Tim-3基因5′端-2500～+202段進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)預(yù)

5、測。 2Tim-3P1與而Tim-3P2 PCR擴(kuò)增選定長2325bp的-2083～+242段，并依據(jù)該段單-Sac I酶切位點(diǎn)，分Tim-3Pl(-2083～-838)和而Tim-33P2(-948～+242)兩部分克隆。設(shè)計(jì)針對Tim-3P1和Tim-3P2的特異性引物，以人基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 3含不同長度人Tim-3基因5′端片段報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Tim-3P1 PCR產(chǎn)物，T-A克隆入pGEM-

6、T，測序正確后，亞克隆入pGL3-Basic相應(yīng)酶切位點(diǎn)構(gòu)建pGL3-Tim-3Pl。Tim-3P2 PCR產(chǎn)物，經(jīng)Sac I、Xho I雙酶切、回收后，插入pGL3-Basic多克隆位點(diǎn)(MCS)構(gòu)建pGL3-Tim-3P2。亦經(jīng)測序鑒定。為增強(qiáng)所構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒的啟動(dòng)子活性，設(shè)計(jì)在上述陽性pGL3-Tim-3P2中引入SV40增強(qiáng)子序列構(gòu)建Enhancer-Tim-3P2，經(jīng)雙酶切鑒定。 4 RT-PCR檢測細(xì)胞系內(nèi)源性Tim-

7、3的表達(dá)收集對數(shù)生長期RAW264.7、B16及COS-75x105，Trizol法抽提細(xì)胞總RNA并行RT-PCR檢測。 5報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染將上述構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒及pGL3-Basic(N性對照)分別與pRL-TK(內(nèi)參照)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染RAW264.7、B16和COS-7(詳見附圖表第二部分)，48h收集細(xì)胞，對細(xì)胞粗提液進(jìn)行雙熒光素酶分析。 6雙熒光素酶分析按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書將細(xì)胞裂解后與底物混合，用熒光

8、計(jì)數(shù)儀檢測所構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒中螢火蟲熒光素酶活性M1與pRL-TK中海腎熒光素酶活性M2，M1/M2的比值即為目的片段的相對活性。每種質(zhì)粒設(shè)2復(fù)孔，同一轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。 7 Tim-3P1與Tim-3P2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBSs)分析同樣利用在線Matlnspector軟件分析Tim-3P1與Tim-3P2中可能存在的TFBSs。 研究結(jié)果： 1人Tim-3啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測分析顯示-2500～+202段存在多

9、個(gè)TATA box、CAAT box及多個(gè)重要TFBSs，可能具有啟動(dòng)子活性。 2成功構(gòu)建人Tim-3啟動(dòng)子螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒測序鑒定證實(shí)pGL3-Tim-3P1、pGL3-Tim-3P2構(gòu)建成功；酶切鑒定證實(shí)Enhancer-Tim-3P2構(gòu)建成功。 3不同細(xì)胞系內(nèi)源性Tim-3的表達(dá)RT-PCR檢測顯示RAW264.7和B16表達(dá)內(nèi)源性Tim-3，而COS-7不表達(dá)。 4報(bào)告質(zhì)粒啟動(dòng)子活性的驗(yàn)證雙熒光素酶

10、分析證實(shí)pGL3-Tim-3P1與pGL3-Tim-3P2均具有較弱的啟動(dòng)子活性，其中，pGL3-Tim-3P2相對活性約是pGL3-Basic空載體的2倍，且啟動(dòng)子活性具有細(xì)胞特異性；引入增強(qiáng)子的Enhaucer-Tim-3P2啟動(dòng)子活性明顯升高。 5 TFBSs分析結(jié)果顯示Tim-3P1含有下列TFBSs：①1個(gè)c-Myb、lk-1、Yyl(Y'mandYang 1，陰陽1)、GATA-3(GATA-binding fact

11、or-3)和CHOP；②2個(gè)FOXK2、HNF-3(hepatocyte nuclear factor-3，肝細(xì)胞核因子-3)；③6個(gè)TATAbox；Tim-3P2含有下列TFBSs：①1個(gè)RFX1、p53、GATA-3、NFAT(Nuclear factor of activated T cells，活化T細(xì)胞核因子)和CDE/CHR(Cell cycle-dependentelement，細(xì)胞周期依賴性元件；cell cycle g

12、enes homology region，細(xì)胞周期基因同源區(qū))；②2個(gè)MZFl(Myeloid zinc finger protein-1)；③3個(gè)YY1；④5個(gè)TATAbox。 結(jié)論：及意義： 本部分成功構(gòu)建了含人Tim-3啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和帶有增強(qiáng)子序列的報(bào)告質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究Tim-3表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。鑒于Tim-3在免疫應(yīng)答中的重要作用，深入研究其表達(dá)調(diào)控將具有重要的理論意義和良好的應(yīng)用前景。

13、 第三部分人Tim-3逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建研究 目的：構(gòu)建人Tim-3逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Tim-3表達(dá)調(diào)控機(jī)制、探索利用Tim-3治療疾病的可行性奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 設(shè)計(jì)針對人Tim-3 mRNA的特異性引物，以hTim-3-pGEM-T為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCX2的HindⅢ、Not I位點(diǎn)，構(gòu)建pLNCX2-Tim-3。經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定正

14、確后，轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞，48h抽提總RNA并RT-PCR檢測Tim-3的表達(dá)。PT67空細(xì)胞和pLNCX2空載體轉(zhuǎn)染的PT67細(xì)胞作對照。 研究結(jié)果： PCR、酶切及測序鑒定證實(shí)重組載體pLNCX2-Tim-3構(gòu)建成功；RT-PCR顯示pLNCX2-Tim-3在包裝細(xì)胞PT67中可有效表達(dá)Tim-3。 結(jié)論：及意義： 成功構(gòu)建了有效表達(dá)人Tim-3的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Tim-3表達(dá)調(diào)控機(jī)制及