逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi抑制Hela細(xì)胞Pokemon基因表達(dá)的研究.pdf

1、Pokemon分子在人類腫瘤如T、B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等疾病的腫瘤中異常高表達(dá)，被直接證明是腫瘤發(fā)生的一個關(guān)鍵因素。POK蛋白家族成員在胚胎發(fā)育分化和致瘤中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Pokemon(POK細(xì)胞髓樣發(fā)生因子，亦稱為LRF,OCZF和FBI-1)是POK蛋白家族成員，由Zbtb7基因編碼，在細(xì)胞分化中作用居多并且自身能夠影響其它的POK家族成員。缺失Zbtb7基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞對其它原癌基

2、因(如E1A、Ras、Myc和T-Ag等)介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化完全無反應(yīng)；在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中Pokemon的過表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，并且證明了它是通過直接結(jié)合而特異地抑制腫瘤抑制基因ARF的轉(zhuǎn)錄。Pokemon基因的作用模式為：Pokemon↑↑→ARF↓→MDM2→p53↓→腫瘤發(fā)生。因此，以Pokemon基因為靶標(biāo)的腫瘤基因治療具有十分重要的意義。 為解決靶向沉默Pokemon基因來治療腫瘤的問題，我們借鑒了近幾年來出現(xiàn)的有關(guān)RN

3、A干擾(RNAinterference，RNAi)的實驗研究。RNAi是出現(xiàn)在多種生物體內(nèi)、進化上高度保守的一種基因保護機制，被稱為“基因組的免疫系統(tǒng)”。其基本作用途徑為：長dsRNA被具有RNaseⅢ活性的Dicer復(fù)合體切割成21-23bp的小雙鏈RNA或稱為小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，siRNA的負(fù)鏈與其它多種成分組成RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)，最后通

4、過堿基配對的方式觸發(fā)同源mRNA的特異性降解?，F(xiàn)在，siRNA已經(jīng)成為應(yīng)用于臨床疾病防治研究的有力工具。已經(jīng)證實，siRNA對HBV、HIV等病毒和前列腺癌、白血病等腫瘤細(xì)胞基因都有很好的沉默作用。這些都為本課題研究將RNAi應(yīng)用到腫瘤的基因治療領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。 基于此，本研究利用RNAi技術(shù)對Pokemon基因表達(dá)進行抑制以達(dá)到治療腫瘤的目的，進行了以下研究： 1、針對Pokemon基因的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表

5、達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 (1)設(shè)計針對Pokemon基因的靶序列：利用美國著名RNA產(chǎn)品公司Ambion提供的網(wǎng)上在線設(shè)計工具，記錄每個AA的3'-端19個氨基酸作為潛在siRNA靶位點。潛在靶位點通過BLAST分析，去除同源性的靶序列，選擇GC含量在40-55％的靶位點序列，按在ORF中平均分布的原則，選取4個siRNA靶標(biāo)。 (2)構(gòu)建并鑒定Pokemon基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒：將設(shè)計合成的寡核苷酸鏈克隆入pSil

6、encer5.1-H1Retro載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli。制備的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定證明重組成功。 2、質(zhì)粒介導(dǎo)型siRNA體外抑制Pokemon基因表達(dá)的研究 (1)選取4種細(xì)胞：Hela、COS-7、293和Jurkat，用RT-PCR方法檢測細(xì)胞中Pokemon基因的表達(dá)。 (2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入表達(dá)Pokemon基因的體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞和不表達(dá)Pokemon基因的293細(xì)胞：首先確定最佳細(xì)胞

7、接種密度和嘌呤霉素的最適篩選濃度，然后，按照Ambion公司siPORTTM技術(shù)將4組重組質(zhì)粒和陽性對照質(zhì)粒H1Cyclo、陰性對照質(zhì)粒H1Scr轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞和293細(xì)胞。 (3)鑒定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的體外基因沉默效果：繼續(xù)嘌呤霉素篩選擴大培養(yǎng)，將存活細(xì)胞做RT-PCR鑒定基因沉默效果。 3、Pokemon基因的siRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備及感染效果評價 (1)DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)PT67包裝細(xì)胞 (2

8、)按照Ambion公司的siRNATMPORT轉(zhuǎn)染試劑說明書及BD公司PT67包裝細(xì)胞使用說明轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備細(xì)胞系 (3)接種NIH3T3細(xì)胞，用PT67產(chǎn)生的病毒上清感染細(xì)胞，測定病毒滴度并收集貯存病毒。 (4)取已感染病毒的Hela細(xì)胞和未感染的Hela細(xì)胞做軟瓊脂培養(yǎng)，集落計數(shù)，統(tǒng)計學(xué)分析鑒定體外基因沉默效果。 結(jié)果顯示，我們設(shè)計合成的4對siRNAs模板DNA片段連接到p

9、Silencer5.1-H1Retro載體后，經(jīng)過抗生素抗性篩選、雙酶切和測序鑒定，顯示我們已經(jīng)成功地克隆了這些DNA片段。通過RT-PCR方法，我們鑒定了Hela細(xì)胞系高表達(dá)Pokemon基因，而COS-7、293和Jurkat細(xì)胞中未見明顯的表達(dá)。將上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)Pokemon基因的Hela細(xì)胞和不表達(dá)Pokemon基因的對照293細(xì)胞后，結(jié)果顯示Hela細(xì)胞中的Pokemon基因表達(dá)顯著受到抑制，其中重組質(zhì)粒H