逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)RNAi沉默Erβ對人成骨樣MG63細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的影響.pdf

1、目的：雌激素通過雌激素受體(Estrogen receptor，ER)介導(dǎo)參與骨代謝過程。自從雌激素受體β(Estrogen receptor beta，ERβ)被發(fā)現(xiàn)后，人們對雌激素的作用方式產(chǎn)生了全新的認(rèn)識，這一發(fā)現(xiàn)為研究雌激素受體在骨代謝中作用機(jī)制開辟了新的途徑。此外，由成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞執(zhí)行的骨形成與骨吸收貫穿于骨代謝的全過程。而表達(dá)于成骨細(xì)胞表面的OPG/RANKL系統(tǒng)在闡明骨代謝發(fā)生機(jī)制方面具有重要意義，特別是OPG/RAN

2、KL比率的改變可以影響骨吸收和骨形成，從而影響骨代謝。本研究的主要目標(biāo)包括：①構(gòu)建針對人ERβ基因逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)表達(dá)載體pRNAT-H1.4/Retro-shRNA并包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒。②將其轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞株MG63，觀察其對人成骨樣MG63細(xì)胞中ERβ基因表達(dá)的影響。③構(gòu)建人成骨樣細(xì)胞ERβ基因敲低細(xì)胞模型并觀察在雌激素干預(yù)下ERβ表達(dá)受抑后對人成骨樣MG63細(xì)胞株的OPG/RANKL比值的影響。為探討ERβ基

3、因如何調(diào)節(jié)骨代謝提供新的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：①根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的ERβ基因核苷酸序列，選擇設(shè)計(jì)3條針對人ERβ干擾靶序列，再轉(zhuǎn)化為能表達(dá)其小發(fā)央結(jié)構(gòu)RNA(small hairpin RNAs，shRNA)的DNA序列，并與pRNAT-H1.4/Retro質(zhì)粒定向連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序進(jìn)行鑒定。將pRNAT-H1.4/Retro

4、-ERβ-shRNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒。②對體外培養(yǎng)的MG63細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及苔盤蘭-瑞氏染色。將包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒，以空白及非特異性shRNA(shRNAnc)作為對照，感染人成骨樣MG63細(xì)胞株，用流式細(xì)胞儀檢測感染效率，然后各組于轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞分別抽提RNA及蛋白，半定量RT-PCR法檢測細(xì)胞中ERβ mRNA表達(dá)水平的改變，Western blot法檢測ERβ蛋白表達(dá)的變化，從而篩選最有效的干擾序

5、列。⑨將含有最有效干擾序列及非特異性shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染人成骨樣MG63細(xì)胞株后，篩選穩(wěn)定克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，以空白及非特異性shRNA作為對照，半定量RT-PCR法及Western blot法檢測穩(wěn)定抑制ERβ的效率；MTT法測定RNAi干擾ERβ后對人成骨樣MG63細(xì)胞增殖的影響；然后分別向三組細(xì)胞即MG63細(xì)胞、ERpshRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MG63細(xì)胞、陰性對照shRNAnc逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MG63細(xì)胞加入10-8mol

6、/L的17β-雌二醇(E2)干預(yù)，48h后收集細(xì)胞，分別抽提RNA及蛋白。應(yīng)用半定量RT-PCR法、Western blot法檢測人成骨樣細(xì)胞株MG63的OPG、RANKL mRNA和蛋白表達(dá)情況。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，組間進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA)后，再用LSD法進(jìn)行多個樣本均數(shù)間的顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P值<0.05表示顯著性差異。

7、
　　 結(jié)果：①針對人ERβ分別構(gòu)建了3種shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRBA1，pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA2，pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA3。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定分析證實(shí)目的序列己插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn)，符合設(shè)計(jì)要求，測序鑒定表明重組質(zhì)粒中含有針對ERβ基因的目的序列，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。并經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞后成功包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒。②感染

8、結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能高效、穩(wěn)定的感染人成骨樣MG63細(xì)胞株，感染效率為70％左右。瞬轉(zhuǎn)的結(jié)果表明：3種shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對人成骨樣MG63細(xì)胞株的ERβ mRNA抑制率分別為44.77±5.41％、61.21±4.47％、80.11±1.72％，蛋白抑制率分別為44.844±0.96％、62.52±1.02％、81.18±0.73％(均P<0.05)。其中pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA3對人成骨樣MG6

9、3細(xì)胞株的ERβ抑制效率最高。⑨用pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA3進(jìn)一步穩(wěn)轉(zhuǎn)人成骨樣MG63細(xì)胞株，與空白及陰性病毒對照組相比，篩選出ERβ表達(dá)穩(wěn)定抑制的人成骨樣細(xì)胞株，ERβmRNA抑制率為88.17±1.17％(P<0.05)，蛋白抑制率為89.01±1.22％(P<0.05)。MTT法顯示RNAi干擾ERβ后人成骨樣MG63細(xì)胞增殖末見明顯變化。雌激素干預(yù)48h后，顯示ERβ穩(wěn)定抑制的MG63細(xì)胞較空白組及陰

10、性對照組OPG mRNA上調(diào)15.51±1.72％，蛋白表達(dá)上調(diào)20.35±1.15％(P<0.05)，RANKL mRNA下調(diào)22.17±0.94％，蛋白表達(dá)下調(diào)27.22±1.48％(P<0.05)，OPG/RANKL表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：①應(yīng)用pRNAT-H1.4/Retro載體成功構(gòu)建了3種pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并包裝成pRNAT-H1.4/Retro-ERβ

11、-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒。②包裝后的3種ERβ-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒均能高效、穩(wěn)定的感染人成骨樣MG63細(xì)胞，并顯著抑制ERβ的表達(dá)。其中以ERβ-shRNA3為最佳的干擾序列。③成功建立了人成骨樣細(xì)胞雌激素受體β亞型基因敲低細(xì)胞模型。并發(fā)現(xiàn)在雌激素干預(yù)下通過利用RNAi沉默ERβ基因后可上調(diào)人成骨樣MG63細(xì)胞OPG mRNA和蛋白表達(dá)、下調(diào)RANKL mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)OPG/RANKL表達(dá)，從而提示ERβ可能通過調(diào)節(jié)OPG/R