乙型肝炎病毒易感細胞系的篩選.pdf

1、乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是一種小的雙鏈、嗜肝DNA病毒，具有高度的種屬和組織特異性，只感染人和類人猿。目前應用較多的HBV感染細胞模型有如下三類：①整合HBV全基因組至肝癌細胞，其可表達HBV復制中間產物，并分泌HBV顆粒，應用最廣泛的為HepG2.2.15細胞系；②利用肝癌細胞瞬時轉染攜帶HBV全基因組的質粒；③利用腺病毒系統導入HBV基因組；④利用桿狀病毒導入HBV基因組。但HBV在上述細胞模型中的復制

2、過程均非HBV自然感染過程，不能體現HBV生命周期各方面，特別是病毒特殊的細胞受體及進入細胞核的機制。人類或樹鼩肝細胞培養(yǎng)可直接感染HBV顆粒，但其缺點是來源和制備困難，感染效率也較低，維持時間短。法國學者Gripon等建立的肝癌細胞系HepaRG，可以被含HBV的血清直接感染，但感染前細胞需在一定條件下誘導分化，且病毒復制水平太低，感染能力尚不穩(wěn)定。因此，目前缺乏高效HBV易感細胞模型。確立一種自然易感乙肝病毒的細胞系對乙肝病毒的研究

3、及慢性乙肝的治療非常重要。本研究通過用表達殺稻瘟菌素（Bsd）抗性的重組HBV顆粒感染多種肝癌細胞，經殺稻瘟菌素多輪篩選，提供了一個維持HBV自然感染和復制的細胞模型。并利用這一細胞模型，觀察了拉米夫定的抗病毒作用。
　　目的：篩選一個可維持HBV感染與復制的細胞模型
　　方法：取肝癌患者的癌組織，經分離培養(yǎng)并連續(xù)傳代后，有15例獲得了較好生長狀態(tài)的細胞，連同本實驗室的HepG2、Huh7、QSG-7701、SMMC-772

4、1細胞系，感染表達Bsd抗性基因的重組HBV-Bsd顆粒，應用Bsd篩選抗性克隆。經篩選前后比較，確定一株有前景的細胞，繼續(xù)進行8輪篩選（S1-S8），每輪篩選均留存細胞備用。將QSG-7701-S0至QSG-7701-S8多代細胞感染HBV攜帶者血清，通過ELISA、熒光定量PCR檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBVDNA含量，并提取細胞裂解液SouthernBlot檢測HBVDNA，以證明經過多輪篩選后，細胞對HBV的感染性增強。

5、為進一步研究最終確定的HBV易感細胞系的特性，感染HBV后，通過SouthernBlot，觀察其對HBV感染劑量的依賴性；通過感染表達熒光蛋白的重組HBV-hrGFP顆粒，觀察GFP的表達；并在感染后不同時間，經SouthernBlot、NorthernBlot和ELISA檢測病毒復制中間體、HBVRNA及培養(yǎng)液中HBsAg變化；利用這一細胞模型，通過Southern觀察拉米夫定的抗病毒作用。
　　結果：取篩選后獲得的S1(sel

6、ection1)細胞與相應的S0細胞，感染高滴度HBV攜帶者血清，8天后取細胞培養(yǎng)上清液，應用化學發(fā)光法定量檢測HBsAg，發(fā)現QSG-7701細胞對HBV的易感性基礎水平最高，后續(xù)試驗以此細胞株繼續(xù)傳代培養(yǎng)，并連續(xù)8輪篩選，分別命名為S1-S8。取S0、S1、S3、S5、S7、S8細胞，感染高滴度HBV攜帶者血清，用化學發(fā)光法檢測細胞培養(yǎng)上清液，發(fā)現HBsAg有明顯升高趨勢，S8細胞上清中HBsAg含量達15.8ng/ml。應用熒光定

7、量PCR檢測了上清液中HBVDNA，也提示有明顯升高趨勢。收集細胞裂解液，提取HBVDNA，經SouthernBlot檢測，發(fā)現HBV復制能力逐漸增強。HBV復制中間體在S8中有相對較高水平表達。
　　在QSG-7701-S8細胞中，分別加入不同劑量的HBV感染者血清，應用化學發(fā)光法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg，發(fā)現其與感染的病毒量呈明顯劑量依賴性。利用重組HBV顆粒HBV-hrGFP，感染QSG-7701-S0、QSG-770

8、1-S8細胞系，在熒光顯微鏡下發(fā)現QSG-7701-S8對HBV的易感性明顯增加。QSG-7701-S8感染HBV感染者血清后不同時間點，分別收集細胞裂解液，提取細胞內總DNA，行SouthernBlot檢測，于感染6天可見少量復制中間體，9和12天可見HBVDNA量明顯增加，并可見cccDNA形成。提取細胞內總RNA，行NorthernBlot檢測，證實在感染后6天起，檢測到HBVRNA的表達，并隨時間不斷增加。應用化學發(fā)光法檢測，發(fā)

9、現細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg自5天開始升高，8-10天達高峰（16ng/ml），隨后逐步下降。通過SouthernBlot檢測，發(fā)現DMSO可強化HBV復制。行體外抗病毒實驗，并經SouthernBlot證實，拉米夫定可抑制HBV復制并呈劑量依賴性。
　　結論：本實驗結果表明，QSG-7701細胞可自然感染HBV，并能維持病毒復制，經Bsd篩選，感染效率及復制能力明顯提高。本實驗提供了一個可以自然HBV感染與復制的細胞模型，可為H