人乳頭瘤病毒(HPV)混合型病毒樣顆粒疫苗的實驗研究.pdf

1、宮頸癌是世界第二大高發(fā)婦科腫瘤，慢性持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）感染是宮頸癌的主要誘因。目前已發(fā)現(xiàn)了包括HPV16，-18，-45等合計15種高危型HPV，其中HPV16，-18是全球范圍優(yōu)勢流行的病毒株，因此國外上市的兩種預防宮頸癌的病毒樣顆粒（VLP）疫苗都只包含HPV16，-18兩種型別，可預防HPV16，-18感染相關的約70％的宮頸癌。而其它高危型的流行情況在各個地區(qū)的有一定的差異

2、。在我國，除HPV16，-18是誘發(fā)宮頸癌的優(yōu)勢流行病毒株之外（檢出率分別為58.7％和11％），HPV58的感染率也很高（7.2％），居于第三位，其它如HPV33，-52，-31的檢出率也都在2％以上，其中HPV33，-52的檢出率比歐美地區(qū)相應型別的檢出率高。因此，在HPV16，-18的基礎上繼續(xù)增加包括HPV58在內的我國其它主要優(yōu)勢流行病毒型別，研發(fā)相應的多價L1 VLP混合型疫苗對于預防我國婦女宮頸癌的發(fā)生具有重要意義。

3、>　　 本研究利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達體系，首先通過聯(lián)合采用偏性密碼子、mRNA二級結構調整等多種策略優(yōu)化改造HPV16，-18，-58病毒主要外殼蛋白L1基因，分別構建高滴度重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞表達L1 VLP，分離純化HPV16，-18，-58 L1 VLP。然后采用不同的配伍方案，包括劑量配伍及聯(lián)合佐劑配伍等方案，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP多價疫苗，肌肉免疫BALB/c小鼠，通過VLP-ELISA檢測免

4、疫血清VLP結合抗體的水平及持續(xù)時間，通過假病毒中和實驗檢測評價血清中和抗體的水平。在分析VLP混合免疫同時誘發(fā)針對疫苗組分型別特異性體液免疫反應的基礎上，重點分析混合免疫是否存在免疫干擾，并探討分析誘發(fā)免疫干擾的相關因素及克服方法，確立HPV16，-18，-58 L1 VLP混合型多價疫苗的最佳免疫方案。結果如下：
　　 1.HPV16，-18，-58 L1改造基因的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞后，SDS-PAGE考馬斯亮蘭染色及

5、Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，L1改造基因可在昆蟲細胞中高水平表達，L1重組蛋白純化后經電鏡分析均可自組裝成大小及形態(tài)與天然病毒類似的病毒樣顆粒。
　　 2.按照每種型別VLP5μg的劑量，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP三價疫苗，同時設HPV16，-18，-58，-6，-11 L1 VLP五價疫苗及相應單價疫苗為對照組。VLP-ELISA法檢測分析結果表明，混合免疫可同時誘發(fā)針對疫苗組分型別的高水平VLP-EL

6、ISA結合抗體，兩次免疫后HPV16，-18，-58 L1 VLP結合抗體的滴度分別高達2×104，2.5×104，2.5×104，三次免疫后針對這三種型別的結合抗體滴度分別高達3.1×104，6.3×104，6.3×104，均可持續(xù)至少一年時間，且各型VLP結合性抗體滴度在混合免疫組及單獨免疫組之間沒有顯著差異；假病毒中和實驗結果顯示，混合免疫血清可同時中和HPV16，-18，-58型假病毒，阻止其報告基因的表達，兩次免疫后針對HPV

7、16，-18，-58假病毒中和抗體滴度分別高達4.5×103，104，2.9×103，三次免疫后針對這三種型別的中和抗體滴度分別高達1.5×104，1.5×104，4.5×103，但混合免疫組誘發(fā)產生的針對HPV16，-18，-58的中和抗體均較其相應的單獨免疫組的低，且五價免疫組誘發(fā)的中和抗體水平較三價免疫組進一步降低。表明混合免疫型別之間存在免疫干擾現(xiàn)象。
　　 3.在HPV16，-18 L1 VLP配伍劑量為5μg不變的情

8、況下，將HPV58 L1 VLP的劑量增加至10μg，混合后肌肉免疫。免疫血清中和活性檢測發(fā)現(xiàn)增加HPV58 VLP的劑量可部分消除對HPV58型的免疫干擾，但對HPV16，-18型的免疫干擾有所增強。
　　 4.在HPV16，-18，-58 L1 VLP每種型別劑量均為5μg的情況下，將其中一種型別的VLP在小鼠一側后肢肌肉免疫，另外兩種混合后在另一側后肢免疫。免疫血清中和活性檢測發(fā)現(xiàn)，分為點免疫可以減弱對單獨免疫型別的免疫干

9、擾現(xiàn)象，但不能完全消除免疫干擾。
　　 5.將每種型別的VLP劑量降低到0.1μg，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP三價疫苗，同時設HPV16，-18 L1 VLP雙價疫苗，HPV16，-18，-58，-6，-11 L1 VLP五價疫苗及相應單價疫苗為對照組。假病毒中和實驗分析結果顯示，低劑量混合免疫可同時誘發(fā)針對HPV16，-18，-58的中和抗體，兩次免疫后中和抗體滴度分別為4×102，2×102，4×102，對

10、疫苗中所有型別的免疫干擾現(xiàn)象均有所減弱，但免疫干擾程度仍隨著疫苗中抗原價次的增加而增強。
　　 6.將氫氧化鋁佐劑按比例與低劑量（每型0.1μg）VLP混合，配制復合有佐劑的多價疫苗，包括HPV16，-18雙價疫苗，HPV16，-18，-58三價疫苗及HPV16，-18，-58，-6，-11五價疫苗。免疫血清中和活性分析發(fā)現(xiàn)，低劑量組復合佐劑免疫后產生的干擾現(xiàn)象較單純低劑量免疫組的低，并且免疫干擾隨疫苗中抗原價次增加而增強的趨勢

11、變得不明顯。
　　 綜上所述，本研究結果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合采用偏性密碼子、mRNA二級結構調整的方法自主優(yōu)化獲得的HPV L1基因能在桿狀病毒.昆蟲細胞表達體系內高水平表達生產L1 VLP，HPV16，-18，-58 L1 VLP混合免疫可同時誘發(fā)針對疫苗組分型別的高水平中和抗體，并首次發(fā)現(xiàn)HPV VLP混合免疫時會產生免疫干擾，增加某一型別的免疫劑量可部分克服對這種型別免疫干擾，但會增加對其它型別的免疫干擾，降低免疫劑量及聯(lián)合使用佐劑