人乳頭瘤病毒59型L1病毒樣顆粒(VLP)的全原子結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、高危型人乳頭瘤病毒(HPV)被證實(shí)是誘發(fā)女性宮頸癌的主要病原體。流行病學(xué)調(diào)查顯示98％的宮頸癌都是由人乳頭瘤病毒(HPV)感染引起，其中，HPV59型是引起宮頸癌的主要型別之一。HPV的主要衣殼蛋白L1與病毒的吸附、病毒基因型及誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等作用緊密相關(guān)，是HPV疫苗的主要成分。HPV病毒樣顆粒(VLP)是由L1五聚體組成，同時(shí)保留了其天然的免疫表位。因此，開展對(duì)HPV59L1蛋白五聚體及其組成的VLP結(jié)構(gòu)特征的研究對(duì)闡明HPV5

2、9型特異表位和VLP組裝機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)等提供參考，并為HPV宿主及組織特異性研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 首先，本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，成功的表達(dá)了HPV59L1蛋白，利用陽(yáng)離子交換層析和羥基磷灰石層析等純化方法，獲得了純度大于95％的L1蛋白。在進(jìn)一步的組裝研究中，考察了組裝溫度對(duì)HPV59L1 VLP組裝的影響，研究中發(fā)現(xiàn)，在常溫組裝后置于37℃中溫育的組裝條件下，L1蛋白能形成均一的直徑為60nm左右的二十面體VLP。接著，

3、利用低溫電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)成功重建了HPV59L1 VLP的三維結(jié)構(gòu)，分辨率為9.5(A)，從結(jié)構(gòu)中，可以看出，HPV59L1 VLP表面五聚體相互之間的連接方式有三種:雙弧線連接，單直線連接和雙直線連接;從低溫電鏡表面密度值可以看出，HPV59L1 VLP表面的五鄰體(5-coordinatedpentamer)和六鄰體(6-coordinated pentamer)是存在結(jié)構(gòu)差異的。
　　 其次，本研究通過(guò)L1蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)突

4、變制備了穩(wěn)定均一的HPV59L1五聚體。并將HPV59L1五聚體進(jìn)行晶體培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)條件的篩選和優(yōu)化，獲得了三個(gè)能夠獲得適合衍射晶體的結(jié)晶條件，其中一顆晶體并通過(guò)X-射線衍射實(shí)驗(yàn)收集了一套用于結(jié)構(gòu)解析的衍射數(shù)據(jù)，接著使用HKL2000，CCP4和COOT軟件，通過(guò)分子置換方法，解析了HPV59L1五聚體的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到3.7(A)。將該HPV59五聚體結(jié)構(gòu)與已報(bào)道HPV11/16/18/35四型別的五聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HPV5

5、9的BC環(huán)與其他四型別差異較大，提示該區(qū)域可能存在較多地HPV59型特異的表位;而五個(gè)型別結(jié)構(gòu)中對(duì)于顆粒組裝具有關(guān)鍵作用的EF環(huán)沒有體現(xiàn)出明顯差異，提示HPV59與其他四型別具有相似的組裝機(jī)制。
　　 最后，通過(guò)同源模建的方法構(gòu)建HPV59五聚體結(jié)構(gòu)上缺失的α4環(huán)的結(jié)構(gòu)，接著利用Fitting技術(shù)將完整的HPV59五聚體晶體結(jié)構(gòu)與HPV59L1 VLP低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)結(jié)合，獲得完整的HPV59L1 VLP原子模型。并進(jìn)一步對(duì)該結(jié)

6、構(gòu)模型進(jìn)行分析得出，五鄰體與六鄰體之間通過(guò)相鄰單體上Cys175與Cys428之間相互作用，且分屬于不同五聚體的相鄰單體CD環(huán)上的Phe82、Gly83、Pro85、Thr88和Val89之間可能會(huì)通過(guò)強(qiáng)疏水作用相互作用;而六鄰體與六鄰體之間的相互作用僅由Cys175和Cys428的二硫橋維系。
　　 綜上所述，本研究成功地獲得了HPV59T=7的二十面體VLP的全原子結(jié)構(gòu)，從原子水平上闡明了HPV59L1蛋白組裝的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，從