腺病毒介導雙自殺基因選擇性殺傷血管內(nèi)皮細胞的研究.pdf

1、目的:研究腺病毒介導的雙自殺基因在KDR啟動子調(diào)控下對血管內(nèi)皮細胞的選擇性殺傷作用,為進一步開展腫瘤血管的靶向治療研究奠定基礎.首先利用改進的AdEasy系統(tǒng)構建攜帶KDR啟動子/CMV啟動子調(diào)控的雙自殺基因的重組復制缺陷型腺病毒.針對傳統(tǒng)的細菌內(nèi)同源重組法制備腺病毒過程仍較復雜,成功率低和對實驗室條件要求高等缺點,通過先構建AdEasier-1細菌后進行細菌內(nèi)同源重組的"兩步轉(zhuǎn)化法"來簡化實驗過程,縮短實驗周期,提高成功率.構建好的腺

2、病毒用于感染HUVEC細胞和LoVo細胞,測定感染效率,檢測轉(zhuǎn)基因的表達,對轉(zhuǎn)基因細胞施以前藥(5-FC和/或GCV),觀察轉(zhuǎn)基因細胞對前藥的敏感性,比較不同轉(zhuǎn)基因細胞對前藥的敏感性差異.方法:一、構建重組腺病毒 應用PCR擴增出KDR啟動子、CD基因、TK基因序列,構建pKDR-CDglyTK質(zhì)粒;以Adeasy-1系統(tǒng)為載體,采用細菌內(nèi)同源重組"兩步轉(zhuǎn)化法"構建攜帶KDR啟動子調(diào)控下的CD與TK的融合基因腺病毒重組質(zhì)粒pAdKDR-

3、CDglyTK,同法構建pAdCMV-CdglyTK質(zhì)粒.重組質(zhì)粒在293細胞中包裝成病毒,并進一步擴增、純化,通過在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達觀察重組病毒的包裝與復制,PCR-5-鑒定重組腺病毒.二、基因轉(zhuǎn)移及前藥敏感實驗.以不同的MOI的重組病毒體外感染HUVEC和LoVo細胞,利用重組病毒攜帶的GFP基因,在熒光顯微鏡下觀測重組病毒的感染效率,并給予不同濃度的GCV和/或5-FC,觀測、比較不同前藥或前藥聯(lián)

4、合對不同轉(zhuǎn)基因細胞的殺傷作用.結論:一.KDR啟動子—雙自殺基因系統(tǒng)對臍靜脈內(nèi)皮細胞具有強烈的殺傷作用,其殺傷效率與前藥濃度和重組病毒MOI相關,聯(lián)合應用兩種前藥較單用一種前藥更能有效的殺傷臍靜脈內(nèi)皮細胞.二.KDR基因啟動子可調(diào)控雙自殺基因在血管內(nèi)皮細胞中特異性表達,有利于實現(xiàn)雙自殺基因靶向惡性腫瘤血管內(nèi)皮細胞的抑癌療法.三.兩步轉(zhuǎn)化法是一種非常方便經(jīng)濟的腺病毒構建方法,該法的廣泛應用有利于以腺病毒為基因載體的轉(zhuǎn)基因工程的推廣和普及.