一個新的白細胞膜抗原ZCH-2B8a編碼基因及其生物學特性的研究.pdf

1、血液系統(tǒng)惡性腫瘤是當今醫(yī)學上的頑癥之一，細胞膜表面分化抗原(CD)分子的研究能提高對其生物學行為的認識，有利于診斷治療。通過單克隆抗體(單抗)進而研究細胞膜抗原生物學特性是蛋白質功能研究的重要方法。ZCH(ZhejiangChildren'sHospital)-2B8a(簡稱ZCH-2B8a)是本科研究室自行研制的鼠抗人造血細胞分化抗原的單抗，已經提交第8屆國際人類白細胞分化抗原協(xié)作組會議(HLDA8)鑒定，根據(jù)HLDA8總部經大量研究

2、的反饋信息表明：該抗體識別的抗原性質不明，屬國際上尚未認識的血細胞膜新的分化抗原(新的CD分子)。因此，對其識別抗原編碼基因克隆與測序及其生物學功能研究有著重要的科學意義和潛在的應用前景。 1直標鼠抗人新單抗ZCH-2B8a-FITC的研制及鑒定為了深入研究ZCH-2B8a抗體識別抗原的表達譜及生物學功能，有利于利用流式細胞儀作多色分析和抗原阻滯試驗，減少實驗誤差，擬將該抗體研制成異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisoth

3、iocyanate,FITC)直接標記的抗體2B8a-FITC。在清潔級BALB/c小鼠腹腔內注射1×106能分泌2B8a單抗(2B8aAb)的雜交瘤細胞，制備大量2B8aAb腹水。通過Econo-Pac蛋白A柱進行親和層析，純化2B8aAb，純化后的2B8aAb經SDS-PAGE凝膠電泳檢測，純度高，達99％以上。采用改良Marsshall法，用FITC標記純化的2B8aAb，多余FITC經PBS充分透析除去，用紫外分光光度計測定A4

4、95/A280比值為0.56，介于FITC熒光抗體的理想比值0.3～1.0之間。流式細胞術檢測顯示，直標單抗2B8a-FITC與間接標記法2B8a+GAM-FITC在Raji細胞上的反應峰型相似，雖然前者的平均熒光強度指數(shù)(MFI，98.61)略低于后者(106.89)，但陽性反應率基本一致，分別為99.11％和99.00％，表明直標熒光抗體2B8a-FITC制備成功。 2ZCH-2B8a單抗及其識別抗原的生物學特性為了闡明2B

5、8aAb及其抗原的功能和臨床應用前景，對抗原和抗體的有關生物學特性進行了初步探討。 (1)2B8aAb與正常和惡性腫瘤細胞的反應性：采用多參數(shù)流式細胞術(FCM)檢測2B8aAb與正常及惡性腫瘤細胞的反應性，分析2B8aAb的反應譜，以陽性細胞數(shù)≥20％為陽性。 (2)2B8aAg對胰酶消化的抵抗能力：2B8aAg在胰酶消化過的Raji細胞表面表達明顯降低，由未消化細胞上83.57％的高表達降至26.99％，提示2B8a

6、Ab識別的抗原性質可能是蛋白結構，而非糖基之類的分子。 (3)2B8aAb對Nalm-6細胞生長的影響：應用足以封閉Nalm-6細胞表面抗原的2B8a雜交瘤細胞培養(yǎng)上清(含2B8aAb)與之反應后繼續(xù)培養(yǎng)，并于24h、48h、72h和96h小時計數(shù)細胞數(shù)量。結果顯示：24h、48h、72h和96h細胞數(shù)量與對照組比較，無顯著統(tǒng)計學意義(P值分別為0.132、0.714、0.265和0.763)，說明2B8aAb對Nalm-6細胞

7、生長無影響。 (4)2B8aAb與耐藥和非耐藥白血病細胞株之間的反應性比較：2B8aAb與HL60及其耐長春新堿(VCR)耐藥細胞株HL60/VCR均反應，陽性細胞數(shù)分別為29.64％和47.70％，非參數(shù)檢驗比較，P=0.343＞0.05，沒有統(tǒng)計學意義；2B8aAg在K562母株上中度表達(43.06％)，而在其耐藥株K562/HHT(高三尖杉酯堿)低表達(17.76％)，耐藥株K562/ADR(阿霉素)和K562/VCR少

8、量表達(3.53％和4.44％)，通非參數(shù)檢驗分別比較K562與K562/HHT、K562/ADR和K562/VCR的中位陽性細胞數(shù)，P值分別為0.114＞0.05、0.029＜0.05和0.029＜0.05，2B8aAg在K562耐藥株上的低表達規(guī)律提示2B8aAg可能與耐藥程度有關，其機理尚需進一步研究。 3ZCH-2B8a抗原編碼基因的克隆和測序 鑒于2B8a抗原抗體系統(tǒng)為國際首創(chuàng)，相關的生物學特性和功能均未闡明，

9、對2B8aAb識別抗原的編碼基因進行克隆分析是闡明該抗原抗體系統(tǒng)生物學特性的關鍵方面。經胰酶消化后觀察抗原抗體反應性的研究結果表明：2B8aAg為蛋白質抗原，所以本研究采用T7噬菌體展示系統(tǒng)，觀察2B8aAb識別抗原的能力，克隆2B8aAg的編碼基因并測定其核苷酸序列。由于2B8aAb與Raji細胞膜抗原有明顯的反應性，Raji細胞cDNA中必定存在編碼2B8aAb識別抗原的基因序列，于是我們首先建立T7噬菌體展示的Raji細胞cDNA

10、表達文庫。。初始文庫滴度太低，將文庫擴增后利用和保存，擴增后滴度為2.5×1010pfu/ml。文庫構建成功，利用2B8aAb淘洗文庫，經過五輪淘洗使2B8aAg陽性噬菌體富集達最大量，然后通過噬斑挑取及PCR技術，成功獲得了6個陽性克隆。6個陽性噬斑的cDNA插入片段序列測定后經美國基因庫核酸序列查找(BLASTn)程序進行同源性搜索，結果發(fā)現(xiàn)其中5個插入片斷基因序列與美國NCBI基因庫中一個假定基因(BC094882)是同源序列；再

11、通過DNASIS軟件將5個插入片段的基因序列轉換成的蛋白序列后與BC094882基因編碼的蛋白序列比較，發(fā)現(xiàn)正好與BC094882蛋白羧基末端的228個氨基酸序列完全吻合，但與其羧基末端第229位～236位已測出的8個氨基酸序列完全不同。此基因在淋巴結生發(fā)中心B細胞中表達，基因全長2436bp，開放閱讀框為61～2280bp，編碼739個氨基酸。由此推測，2B8aAb所識別的抗原蛋白基因可能是假定基因BC094882，但仍然需要進一步研