骨髓源肝干細(xì)胞的克隆化及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、干細(xì)胞是指具有自我復(fù)制能力和分化潛能的細(xì)胞。通常將干細(xì)胞分為兩大類型：胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是指來源于囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有多分化潛能，幾乎可以分化為機(jī)體任何類型的細(xì)胞。成體干細(xì)胞則是指分布于成體組織或器官內(nèi)的干細(xì)胞，這種干細(xì)胞也具有向一個或多個方向分化的潛能。 骨髓是成體干細(xì)胞最多的細(xì)胞庫。骨髓細(xì)胞其主要包括兩大類細(xì)胞。一類是造血細(xì)胞，包括少量的造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和不同發(fā)育階段的血細(xì)胞；另一類是骨髓

2、基質(zhì)細(xì)胞，包括網(wǎng)狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血竇內(nèi)皮細(xì)胞等。一般認(rèn)為，骨髓基質(zhì)細(xì)胞不僅參與骨髓網(wǎng)狀組織的構(gòu)成，對造血細(xì)胞起支持作用，而且通過細(xì)胞間的相互接觸和多種體液因子及粘附分子的作用，調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖、分化和成熟。但研究表明骨髓基質(zhì)細(xì)胞中還存在著具有多向分化的潛能的細(xì)胞群，被稱為骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。其在一定的條件下可向三個胚層的細(xì)胞分化，例如骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)原

3、和肝細(xì)胞等。 大部分從大鼠股骨和脛骨中取得的BMSCs都是通過貼壁法而獲得，但是貼壁的細(xì)胞除了MSCs之外，還有貼壁的吞噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，使得培養(yǎng)的MSCs的在形態(tài)上具有多樣性。MSCs不但在大小，形態(tài)上，而且在分化潛能和擴(kuò)展能力方面也很不一致。各種分離和純化，富集MSCs的方法已經(jīng)迅速發(fā)展，如免疫磁珠和流式技術(shù)，但至今，人們還仍然沒法確定用這些方法富集的細(xì)胞是不是一致性的。因為沒有一種或一組聯(lián)合抗體對MS

4、Cs是特異性的。即使現(xiàn)今報道的非常純化的群體由于在傳代中分化祖細(xì)胞，即過渡細(xì)胞的產(chǎn)生，使得這種純化的細(xì)胞群體也異質(zhì)化。而且，隨著傳代，某些MSCs會保留其多向分化潛能，但也有一些要么只能朝某個特定方向分化，要么開始衰老死亡。因此，成體干細(xì)胞在體外傳代和擴(kuò)增的困難極大地限制了它們的應(yīng)用。很明顯，在臨床廣泛應(yīng)用之前，必須要建立一種在體外大量擴(kuò)展MSCs，但又不能影響其分化潛能的方法。我們基于非平衡細(xì)胞動力學(xué)的抑制(SACK)理論，應(yīng)用了一種

5、新的方法去建立成體干細(xì)胞株(系)并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增。非平衡細(xì)胞動力學(xué)對于成體干細(xì)胞保持其在體內(nèi)的功能是必需的，卻是體外擴(kuò)增的阻力，因此，從非平衡細(xì)胞動力學(xué)向平衡細(xì)胞動力學(xué)的轉(zhuǎn)變將促使成體干細(xì)胞的指數(shù)增殖并保持其在體外長期傳代的穩(wěn)定性。黃苷(Xs)便充當(dāng)了這種角色。 在前期工作中，我們以2-AAF/CCl4程序構(gòu)建急性肝損傷動物模型，取損傷后的肝臟萃取物作為骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的實驗組刺激物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞分子表面

6、標(biāo)志的變化。結(jié)果顯示：實驗組BMSCs誘導(dǎo)至11d表達(dá)幼稚肝細(xì)胞標(biāo)志M2-PK、GST-P，而對照組誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無此改變，這說明損傷的肝臟能夠產(chǎn)生某種因子，可以激活干細(xì)胞向肝細(xì)胞方向的分化。那么，本實驗所得到的單細(xì)胞克隆能否對這些因子產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)了?通過這種誘導(dǎo)的方法，我們可以篩選出能夠向肝細(xì)胞方向分化的干細(xì)胞。 實驗方法：1、利用貼壁法分離培養(yǎng)原代雄性大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，培液中含400μMXs和1ng/mlEGF，

7、 2、再高度稀釋這種混合細(xì)胞并以單細(xì)胞接種于96孔板。記錄并培養(yǎng)擴(kuò)增單細(xì)胞的克隆。 3、采用3％2-AAF/CCl4急性肝損傷模型雌性SD大鼠的肝組織勻漿誘導(dǎo)這些單細(xì)胞克隆，取誘導(dǎo)第十一天和第二十天細(xì)胞，RT-PCR檢測BST-1、GST-P、M2-PK及AlbuminmRNA的表達(dá)；同時用正常同種雌性大鼠肝勻漿作對照培養(yǎng)。 4、對比培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)方法。 結(jié)果：1、得到14株單細(xì)胞克隆，記為C1、C

8、2、C3……C14等； 2、所有單細(xì)胞克隆均表達(dá)髓系來源標(biāo)志BST-1mRNA，誘導(dǎo)11d時，C7、C11、C14三株細(xì)胞表達(dá)BST-1mRNA和幼稚肝細(xì)胞標(biāo)志GST-P及M2-PKmRNA，誘導(dǎo)20d細(xì)胞BST-1、GST-P和M2-PKmRNA的表達(dá)消失，但未見成熟肝細(xì)胞標(biāo)志AlbuminmRNA的表達(dá)出現(xiàn)。其余細(xì)胞株在誘導(dǎo)11d時未見幼稚肝細(xì)胞標(biāo)志GST-P及M2-PKmRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)20d時，AlbuminmRNA也

9、未出現(xiàn)。 3、對比實驗發(fā)現(xiàn)改良培養(yǎng)方法優(yōu)于普通常規(guī)方法，單細(xì)胞克隆培養(yǎng)易于擴(kuò)增。 結(jié)論：(1)本實驗應(yīng)用貼壁分離法從大鼠股骨和脛骨中取得骨髓混合間質(zhì)干細(xì)胞，通過高度稀釋這種混合間質(zhì)干細(xì)胞并以單細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，應(yīng)用“非平衡細(xì)胞動力學(xué)的抑制(SACK)”的新理論，嚴(yán)格按照制作單細(xì)胞克隆的要求，通過傳代和擴(kuò)增，獲得了11株單細(xì)胞克隆。同樣的培養(yǎng)條件下，與非克隆化的骨髓混合間質(zhì)干細(xì)胞對比培養(yǎng)顯示，克隆化的細(xì)胞易于在體外長期

10、快速增殖。 (2)前期實驗已經(jīng)表明，損傷肝勻漿中存在著有誘導(dǎo)干細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化的化學(xué)信號，即某些微量因子。因此，本實驗采用損傷肝勻漿誘導(dǎo)這11株單細(xì)胞克隆。結(jié)果表明，C7、C11、C14三株細(xì)胞的形態(tài)逐漸向上皮細(xì)胞樣改變，并出現(xiàn)了幼稚肝細(xì)胞分子M2-PK和GST-P的表達(dá)，透射電子顯微鏡也顯示了誘導(dǎo)組的細(xì)胞具有了上皮樣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征，說明這三株細(xì)胞可以向肝細(xì)胞方向分化，我們稱之為骨髓源性肝干細(xì)胞。 (3)其他單細(xì)

11、胞克隆株沒有對損傷肝勻漿作應(yīng)答反應(yīng)，說明這些細(xì)胞不能向肝細(xì)胞方向分化，但究竟這些細(xì)胞是不是干細(xì)胞或是其他組織細(xì)胞的祖細(xì)胞則需進(jìn)一步研究。 (4)通過體外傳代擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，三株肝干細(xì)胞在改進(jìn)的培養(yǎng)條件下，其倍增時間為2～3d，而在一般的普通培養(yǎng)條件下，其倍增時間為5～6d。所以，用優(yōu)化的培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞，可以快速增殖肝干細(xì)胞并使其不老化，在此基礎(chǔ)上，如果由細(xì)胞二維培養(yǎng)改為三維培養(yǎng)，則有望在短期內(nèi)為肝病治療提供大量的肝干細(xì)胞。