人前腦啡肽基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細胞系的構(gòu)建及其生物學特性的實驗研究.pdf

1、背景和目的:
　　 慢性疼痛的治療是目前人類尚未解決的難題之一，嚴重地影響了人類的生活質(zhì)量，由于目前臨床使用的鎮(zhèn)痛藥物存在的缺陷，療效不能令人滿意。生物鎮(zhèn)痛由于其模擬人體生理分泌的獨有的特點，具有明顯的優(yōu)勢，是未來疼痛治療的新方向，而轉(zhuǎn)基因細胞移植鎮(zhèn)痛（Transplantation of transgeneic cells for analgesia）則是其中的最具有的發(fā)展?jié)摿Φ姆较颉?br>　　 骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone

2、 marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）來源豐富，組織相容性好，免疫原性低，具有多向分化潛能，是較為理想的移植細胞。內(nèi)源性阿片肽腦啡肽，廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)，是一種重要的鎮(zhèn)痛介質(zhì)。本研究擬利用RT-PCR 法構(gòu)建人前腦啡肽基因（proenkephalin, PENK）的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，建立能表達前腦啡肽基因及分泌腦啡肽蛋白的人骨髓間充

3、質(zhì)干細胞系并對其進行生物學特性的鑒定，為疼痛的基因治療的實驗研究奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 1 攜帶人前腦啡肽基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建從人腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中提取總RNA，RT-PCR 法擴增出前腦啡肽基因全長cDNA，經(jīng)測序正確后，核酸內(nèi)切酶EcoR I、Sal I酶切PCR 產(chǎn)物，定向克隆入pBABE puro載體，重組質(zhì)粒pBABE-PENK經(jīng)酶切及測序鑒定。
　　 2 人前腦啡肽基因修飾的人

4、骨髓間充質(zhì)干細胞系的建立及其生物學特性研究采用直接貼壁法從人骨髓標本中分離hMSCs。采用脂質(zhì)體介導將重組質(zhì)粒pBABE-PENK 轉(zhuǎn)染包裝病毒細胞株P(guān)HOENIX-293T 細胞，收集病毒上清，將其感染人骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)過嘌呤霉素篩選得穩(wěn)定表達PENK的骨髓間充質(zhì)干細胞細胞系。選用連續(xù)傳代培養(yǎng)人前腦啡肽基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細胞系的和未轉(zhuǎn)化的人骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察傳代、凍存和復蘇對細胞形態(tài)及生長的影響；比較兩種細胞的生長特性和

5、繪制生長曲線；流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染兩組細胞的表面標志CD44，CD29，CD34，CD45的表達。將轉(zhuǎn)染前后細胞分別行成脂誘導及成骨誘導，誘導后脂肪細胞油紅染色，成骨細胞茜素紅染色觀察。分別用RT-PCR方法檢測PENK基因的表達、免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定亮氨酸腦啡肽(Leu-enkephalin,LEK）的表達。
　　 3 統(tǒng)計分析：

6、r>　　 實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（SD X ± )或均數(shù)±標準誤（X S X ± )表示。定量資料經(jīng)正態(tài)和方差齊性檢驗后，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及雙因素析因分析，組間兩兩比較采用LSD方法分析，以p<0.05 作為差異有顯著意義的檢驗標準。采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包處理。
　　 結(jié)果:
　　 1 重組質(zhì)粒pBABE-PENK經(jīng)EcoR I、Sal I酶切及測序鑒定正確，重組質(zhì)粒包含人PENK基因完整編碼

7、區(qū)。
　　 2 轉(zhuǎn)染后細胞系可在體外連續(xù)傳代至20代以上；傳代、凍存和復蘇對細胞形態(tài)及生長無影響（P=0.386）。與第4代hMSCs相比，轉(zhuǎn)染后細胞的生長情況沒有明顯差異（P=0.873）。
　　 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后細胞表明標志沒有明顯差異：CD29（P=0.136）、CD44（P=0.352）
　　 表達均（+），而CD34（P=0.466）、CD45（P=0.474）表達均（-）；轉(zhuǎn)染前后細胞均可在體外

8、培養(yǎng)條件上誘導分化為脂肪細胞及成骨細胞，與第4代hMSCs 相比，轉(zhuǎn)染后細胞成脂分化能力沒有明顯差異（P=0.944）。RT-PCR 及免疫熒光法證實hMSC-PENK中PENK基因表達水平升高且細胞內(nèi)LEK含量升高， ELISA法檢測到細胞培養(yǎng)液上清中LEK表達量增高（P<0.001）。
　　 結(jié)論:
　　 1 成功構(gòu)建了含人前腦啡肽原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
　　 2 成功構(gòu)建了人前腦啡肽原基因修飾的人骨髓間充