一個(gè)新的人間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原的鑒定和間充質(zhì)干細(xì)胞亞群生物學(xué)特性的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，是當(dāng)前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在組織器官缺損性疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病、遺傳缺陷等疾病的治療中有著巨大的臨床應(yīng)用前景。隨著MSCs臨床應(yīng)用的進(jìn)程，對(duì)MSCs生物學(xué)特性的研究和認(rèn)識(shí)提出了更高的要求。一直以來(lái)，骨髓MSCs被認(rèn)為是骨髓單個(gè)核細(xì)胞中具有貼壁的特性、并可在體外培養(yǎng)增殖和誘導(dǎo)多向分化的非造血系統(tǒng)的干細(xì)胞。值得注意的是，迄今為

2、止MSCs尚未發(fā)現(xiàn)有特異性的表面分子。目前國(guó)際公認(rèn)的MSCs表型特征為：細(xì)胞表面CD73、CD90、CD105等抗原呈陽(yáng)性，而CD14、CD19、CD34、CD45、HLA—DR等造血譜系分子表達(dá)陰性。由于缺乏鑒定細(xì)胞的特異性標(biāo)志，導(dǎo)致對(duì)MSCs的生物學(xué)特征缺乏嚴(yán)格統(tǒng)一的定義，制約了對(duì)MSCs生物學(xué)特性的研究和認(rèn)識(shí)，使得MSCs的檢測(cè)、分離純化以及應(yīng)用均面臨著巨大的難題。 第1章人間充質(zhì)干細(xì)胞特異性單克隆抗體及其抗原特征的鑒定

3、 為發(fā)現(xiàn)新的MSCs特異的表面標(biāo)志，以期深入研究MSCs的生物學(xué)特性，本研究以培養(yǎng)的人骨髓MSCs為免疫原免疫BALB/C小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)研究制備了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人骨髓MSCs特異性單克隆抗體ZUB1，并對(duì)ZUB1單克隆抗體及其識(shí)別抗原的生物學(xué)特性進(jìn)行了深入研究。通過(guò)對(duì)抗體種屬和組織細(xì)胞特異性鑒定，證實(shí)ZUB1單克隆抗體針對(duì)人MSCs有高度的特異性和敏感性，ZUB1可識(shí)別骨髓、脂肪組織、臍帶組織和臍帶血來(lái)源的MSCs，與大

4、鼠、小鼠和兔骨髓MSCs均無(wú)交叉反應(yīng)。Western—blot結(jié)果顯示，ZUB1單克隆抗體識(shí)別一種分子量約為250KD的抗原分子，該種抗原在13種人血液系統(tǒng)惡性疾病細(xì)胞株和10種人實(shí)體組織細(xì)胞株均無(wú)表達(dá)。骨髓、脂肪組織、臍帶組織和臍帶血來(lái)源的MSCs在傳代擴(kuò)增過(guò)程中形態(tài)基本一致，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)傳代擴(kuò)增細(xì)胞表達(dá)ZUB1抗原的陽(yáng)性率分別為97.58±0.68％、89.50±3.97％、96.63±1.23％、87.23±4.07％，此外CD

5、29、CD44、CD105、CD166、CD146陽(yáng)性標(biāo)記出現(xiàn)單峰，CD3、CD14、CD19、CD34、CD117、CD133、CD45、CD235a、HLA—DR均表達(dá)陰性，傳代細(xì)胞ZUB1抗原和其他各表面抗原表達(dá)均無(wú)顯著性差異。當(dāng)誘導(dǎo)骨髓MSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞定向分化時(shí)，流式細(xì)胞檢測(cè)顯示ZUB1抗原表達(dá)相應(yīng)減弱，提示ZUB1抗原可作為MSCs干細(xì)胞特征的標(biāo)志分子，且可能參與了MSCs分化的細(xì)胞活動(dòng)。 為進(jìn)一步鑒定ZU

6、B1單克隆抗體識(shí)別的抗原表位，我們通過(guò)Western—blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZUB1單克隆抗體識(shí)別的抗原分子量約為250KD，應(yīng)用ZUB1單克隆抗體通過(guò)免疫沉淀的方法從人骨髓MSCs細(xì)胞裂解液中獲取與ZUB1抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，ZUB1抗體蛋白復(fù)合物經(jīng)SDS—PAGE電泳分離后切取蛋白質(zhì)條帶，質(zhì)譜分析提示ZUB1單克隆抗體識(shí)別的分子量為250KD的抗原肽段為非肌性肌球蛋白-9重鏈(non—musclemyosinheavychain9，N

7、MMHCⅡa)。生物信息學(xué)分析提示該類細(xì)胞骨架蛋白的同型異構(gòu)體在不同組織和干細(xì)胞的不同分化階段有不同的異構(gòu)體的表達(dá)，MSCs特異的形態(tài)特征和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)與其多向分化潛能是相適應(yīng)的．該研究進(jìn)一步豐富了對(duì)骨髓MSCs特異性分子特征的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步研究MSCs分化等細(xì)胞活動(dòng)提供了一個(gè)重要的線索． 第2章ZUB1抗原陽(yáng)性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞亞群的鑒定和生物學(xué)特性的研究 隨著對(duì)體外培養(yǎng)MSCs的生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)的深入，研究者利用不同的

8、表面分子分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞以期進(jìn)一步研究和鑒定骨髓原始MSCs及其不同亞群的生物學(xué)特性。利用ZUB1單克隆抗體，我們建立了ZUB1+骨髓MSCs的分離培養(yǎng)體系，并深入研究了ZUB1+骨髓MSCs亞群的生物學(xué)特性。應(yīng)用ZUB1單克隆抗體通過(guò)免疫磁珠分選骨髓單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選后細(xì)胞純度為61.52±6.69％，分選后獲得的ZUB1+骨髓單個(gè)核細(xì)胞體積較小、核質(zhì)比大，符合干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。ZUB1+骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)3天后細(xì)胞貼

9、壁呈梭形，5天后細(xì)胞擴(kuò)增明顯，梭形貼壁細(xì)胞增殖呈集落樣分布，培養(yǎng)15天左右貼壁細(xì)胞達(dá)80％～90％匯合，細(xì)胞形態(tài)均一，且具有很好的增殖活性，細(xì)胞擴(kuò)增至第8代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示ZUB1+骨髓單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后具有MSCs的表型特性，且可誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞。因此，ZUB1單克隆抗體可用于分離富集ZUB1+骨髓MSCs亞群。 一直以來(lái)MSCs缺乏特異性分子標(biāo)志，目前尚無(wú)有效的指標(biāo)可以鑒定骨

10、髓中不同亞群的原始MSCs的含量。CFU—F可用于評(píng)估骨髓單個(gè)核細(xì)胞中MSCs集落的形成情況，也是目前用于評(píng)估骨髓中原始MSCs的數(shù)量的主要指標(biāo)之一。將未分選的骨髓單個(gè)核細(xì)胞、及磁珠分選后ZUB1+和ZUB1-髓單個(gè)核細(xì)胞按2×104/cm2、1×103/cm2、2×104/cm2的細(xì)胞密度分別接種培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)15d，ZUB1+骨髓單個(gè)核細(xì)胞形成CFU—F的數(shù)量和直徑明顯多于未分選的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，而ZUB1-骨髓單個(gè)核細(xì)胞未見集落形

11、成．按照每105單個(gè)核細(xì)胞計(jì)算ZUB1單克隆抗體分選骨髓單個(gè)核細(xì)胞的CFU—F富集指數(shù)(EnrichmentFactor)為193.09±32.81，且ZUB1+骨髓MSCs增殖較快。為進(jìn)一步分析ZUB1+骨髓MSCs的表型特征，對(duì)MSCs公認(rèn)的一系列表面分子檢測(cè)結(jié)果顯示該類細(xì)胞的表型一致：CD29、CD105、CD166、CD146表達(dá)陽(yáng)性，而CD3、CD14、CD19、CD33、CD235a、HLA—DR、CD45、CD34、CD1

12、33、CD117為陰性。由此，我們認(rèn)為ZUB1單克隆抗體可有效地富集骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的MSCs，ZUB1抗原可以作為研究骨髓原始MSCs的分子標(biāo)志；ZUB1+骨髓MSCs體外培養(yǎng)增殖較快，并可多向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞。 本研究制備了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗人骨髓MSCs特異性單克隆抗體，并證實(shí)ZUB1抗原針對(duì)人MSCs有高度的特異性，可用于人MSCs的檢測(cè)、鑒定以及富集骨髓中原始MSCs。ZUB1抗原為一種在MSC